Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Geriausiems rezultatams pasiekti rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Modinių pokyčių (MC) gyvūnų modelių sukūrimas yra svarbus MC tyrimo pagrindas. Penkiasdešimt keturi Naujosios Zelandijos baltieji triušiai buvo suskirstyti į kontrolinės operacijos grupę, raumenų implantacijos grupę (ME grupė) ir branduolio minkštosios implantacijos grupę (NPE grupė). NPE grupėje tarpslankstelinis diskas buvo atidengtas anterolateraliniu juosmens chirurginiu metodu, o adata buvo pradurta L5 slankstelio kūnui netoli galinės plokštelės. NP buvo ištrauktas iš L1/2 tarpslankstelinio disko švirkštu ir sušvirkštas į jį. Buvo išgręžta skylė subchondriniame kaule. Raumenų implantacijos grupėje ir kontrolinės operacijos grupėje chirurginės procedūros ir gręžimo metodai buvo tokie patys kaip NP implantacijos grupėje. ME grupėje į skylę buvo įdėtas raumens gabalėlis, o kontrolinės operacijos grupėje į skylę nieko nebuvo įdėta. Po operacijos buvo atliktas MRT skenavimas ir molekulinės biologijos tyrimai. NPE grupėje signalas pasikeitė, tačiau kontrolinės operacijos grupėje ir ME grupėje akivaizdžių signalo pokyčių nebuvo. Histologinis stebėjimas parodė, kad implantacijos vietoje pastebėta nenormali audinių proliferacija, o NPE grupėje padidėjo IL-4, IL-17 ir IFN-γ raiška. NP implantavimas į subchondrinį kaulą gali sudaryti MC gyvūnų modelį.
Modiniai pokyčiai (MC) yra slankstelių galinių plokštelių ir gretimų kaulų čiulpų pažeidimai, matomi magnetinio rezonanso tomografijoje (MRT). Jie gana dažni asmenims, turintiems susijusių simptomų1. Daugelyje tyrimų pabrėžta MC svarba dėl jo ryšio su juosmens skausmu (JNS)2,3. de Roos ir kt.4 bei Modic ir kt.5 pirmieji nepriklausomai aprašė tris skirtingus subchondrinio signalo sutrikimų tipus slankstelių kaulų čiulpuose. Modiniai I tipo pokyčiai yra hipointensyvūs T1 svertinėse (T1W) sekose ir hiperintensyvūs T2 svertinėse (T2W) sekose. Šis pažeidimas atskleidžia plyšių galines plokšteles ir gretimą kraujagyslių granuliacinį audinį kaulų čiulpuose. Modiniai II tipo pokyčiai rodo stiprų signalą tiek T1W, tiek T2W sekose. Šio tipo pažeidime galima aptikti galinių plokštelių pažeidimus, taip pat histologinį gretimų kaulų čiulpų riebalinį pakeitimą. Modiniai III tipo pokyčiai rodo silpną signalą T1W ir T2W sekose. Pastebėta sklerozinių pažeidimų, atitinkančių galines plokšteles6. MC laikoma patologine stuburo liga ir yra glaudžiai susijusi su daugeliu degeneracinių stuburo ligų7,8,9.
Atsižvelgiant į turimus duomenis, keli tyrimai pateikė išsamių įžvalgų apie MC etiologiją ir patologinius mechanizmus. Albert ir kt. teigė, kad MC gali sukelti disko išvarža8. Hu ir kt. MC priskyrė sunkiai disko degeneracijai10. Kroc pasiūlė „vidinio disko plyšimo“ sąvoką, kurioje teigiama, kad pasikartojanti disko trauma gali sukelti mikroįplyšimus galinėje plokštelėje. Susiformavus įtrūkimui, galinės plokštelės pažeidimas branduolyje pulposus (NP) gali sukelti autoimuninį atsaką, kuris dar labiau skatina MC11 vystymąsi. Ma ir kt. laikėsi panašios nuomonės ir pranešė, kad NP sukeltas autoimunitetas vaidina pagrindinį vaidmenį MC12 patogenezėje.
Imuninės sistemos ląstelės, ypač CD4+ T pagalbininkų limfocitai, vaidina labai svarbų vaidmenį autoimuniteto patogenezėje13. Neseniai atrastas Th17 pogrupis gamina uždegimą skatinantį citokiną IL-17, skatina chemokinų ekspresiją ir stimuliuoja pažeistų organų T ląsteles gaminti IFN-γ14. Th2 ląstelės taip pat atlieka unikalų vaidmenį imuninių atsakų patogenezėje. IL-4, kaip reprezentatyvios Th2 ląstelės, raiška gali sukelti sunkių imunopatologinių pasekmių15.
Nors atlikta daug klinikinių MC tyrimų16,17,18,19,20,21,22,23,24, vis dar trūksta tinkamų eksperimentinių gyvūnų modelių, kurie galėtų imituoti žmonėms dažnai pasireiškiantį MC procesą ir būtų naudojami etiologijai ar naujiems gydymo būdams, pvz., tikslinei terapijai, tirti. Iki šiol pranešta tik apie kelis MC gyvūnų modelius, skirtus pagrindiniams patologiniams mechanizmams tirti.
Remiantis Alberto ir Ma pasiūlyta autoimunine teorija, šiame tyrime sukurtas paprastas ir atkartojamas triušio MC modelis, automatiškai persodinant NP šalia išgręžtos slankstelio galinės plokštelės. Kiti tikslai – stebėti gyvūnų modelių histologines charakteristikas ir įvertinti specifinius NP mechanizmus MC vystymesi. Šiuo tikslu MC progresavimui tirti naudojame tokius metodus kaip molekulinė biologija, MRT ir histologiniai tyrimai.
Du triušiai nugaišo nuo kraujavimo operacijos metu, o keturi triušiai nugaišo anestezijos metu atliekant MRT tyrimą. Likę 48 triušiai išgyveno ir po operacijos nerodė jokių elgesio ar neurologinių požymių.
MRT rodo, kad skirtingose skylutėse įterpto audinio signalo intensyvumas yra skirtingas. NPE grupėje L5 slankstelio kūno signalo intensyvumas palaipsniui keitėsi praėjus 12, 16 ir 20 savaičių po įterpimo (T1W seka rodė silpną signalą, o T2W seka – mišrų ir silpną signalą) (1C pav.), o kitų dviejų įterptųjų dalių grupių MRT vaizdas per tą patį laikotarpį išliko santykinai stabilus (1A, B pav.).
(A) Tipiniai nuoseklūs triušio juosmens slankstelių MRT vaizdai, atlikti 3 laiko taškais. Kontrolinės operacijos grupės vaizduose signalo anomalijų nerasta. (B) ME grupės slankstelių kūno signalo charakteristikos yra panašios į kontrolinės operacijos grupės, ir laikui bėgant įterpimo vietoje reikšmingų signalo pokyčių nepastebėta. (C) NPE grupėje silpnas signalas aiškiai matomas T1W sekoje, o mišrus signalas ir silpnas signalas aiškiai matomi T2W sekoje. Nuo 12 iki 20 savaičių laikotarpio sporadiški aukšti signalai, supantys silpnus signalus T2W sekoje, mažėja.
NPE grupėje slankstelio kūno implantacijos vietoje galima pastebėti akivaizdžią kaulų hiperplaziją, kuri pasireiškia greičiau nuo 12 iki 20 savaičių (2C pav.), palyginti su NPE grupe; modeliuojamuose slankstelių kūnuose reikšmingų pokyčių nepastebėta; kontrolinėje grupėje ir ME grupėje (2C pav. 2A, B).
(A) Slankstelio kūno paviršius implantuotoje dalyje yra labai lygus, skylė gerai gyja, slankstelio kūne nėra hiperplazijos. (B) ME grupėje implantuotos vietos forma yra panaši į kontrolinės operacijos grupės, ir laikui bėgant implantuotos vietos išvaizda akivaizdžiai nepakito. (C) NPE grupėje implantuotoje vietoje pasireiškė kaulų hiperplazija. Kaulų hiperplazija greitai didėjo ir netgi išplito per tarpslankstelinį diską iki priešingos pusės slankstelio kūno.
Histologinė analizė suteikia išsamesnės informacijos apie kaulų formavimąsi. 3 paveiksle parodytos pooperacinių pjūvių, nudažytų H&E, nuotraukos. Kontrolinės operacijos grupėje chondrocitai buvo gerai išsidėstę ir ląstelių proliferacijos neaptikta (3A pav.). Padėtis ME grupėje buvo panaši į situaciją kontrolinės operacijos grupėje (3B pav.). Tačiau NPE grupėje implantacijos vietoje pastebėtas didelis chondrocitų skaičius ir NP tipo ląstelių proliferacija (3C pav.);
(A) Šalia galinės plokštelės matyti trabekulės, chondrocitai tvarkingai išsidėstę, vienodo dydžio ir formos ląstelės, be proliferacijos (40 kartų). (B) Implantacijos vietos būklė ME grupėje panaši į kontrolinės grupės. Matyti trabekules ir chondrocitus, bet implantacijos vietoje nėra akivaizdžios proliferacijos (40 kartų). (B) Matyti, kad chondrocitai ir NP tipo ląstelės žymiai proliferuoja, o chondrocitų forma ir dydis yra nevienodi (40 kartų).
Interleukino 4 (IL-4) mRNR, interleukino 17 (IL-17) mRNR ir interferono γ (IFN-γ) mRNR raiška buvo stebėta tiek NPE, tiek ME grupėse. Palyginus tikslinių genų raiškos lygius, IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų raiška NPE grupėje buvo reikšmingai padidėjusi, palyginti su ME grupe ir kontrolinės operacijos grupe (4 pav.) (P < 0,05). Palyginti su kontrolinės operacijos grupe, IL-4, IL-17 ir IFN-γ raiškos lygiai ME grupėje padidėjo tik nežymiai ir nepasiekė statistinio pokyčio (P > 0,05).
IL-4, IL-17 ir IFN-γ mRNR raiška NPE grupėje parodė reikšmingai didesnę tendenciją nei fiktyvios operacijos grupėje ir ME grupėje (P < 0,05).
Priešingai, ME grupėje raiškos lygiai reikšmingo skirtumo neparodė (P>0,05).
Western blot analizė atlikta naudojant komerciškai prieinamus antikūnus prieš IL-4 ir IL-17, siekiant patvirtinti pakitusį mRNR raiškos modelį. Kaip parodyta 5A ir 5B paveiksluose, palyginti su ME grupe ir kontrolinės operacijos grupe, IL-4 ir IL-17 baltymų kiekiai NPE grupėje buvo reikšmingai padidėję (P < 0,05). Palyginti su kontrolinės operacijos grupe, IL-4 ir IL-17 baltymų kiekiai ME grupėje taip pat nepasiekė statistiškai reikšmingų pokyčių (P > 0,05).
(A) IL-4 ir IL-17 baltymų kiekiai NPE grupėje buvo reikšmingai didesni nei ME ir placebo grupėse (P < 0,05). (B) Western blot histograma.
Dėl riboto operacijų metu gautų žmonių mėginių skaičiaus, aiškius ir išsamius MC patogenezės tyrimus atlikti yra šiek tiek sudėtinga. Bandėme sukurti gyvūnų MC modelį, kad ištirtume galimus jos patologinius mechanizmus. Tuo pačiu metu radiologinis, histologinis ir molekulinės biologijos tyrimai buvo atlikti siekiant stebėti NP autografto sukeltos MC eigą. Dėl to NP implantacijos modelis lėmė laipsnišką signalo intensyvumo kitimą nuo 12 iki 20 savaičių laiko momentų (mišrus silpnas signalas T1W sekose ir silpnas signalas T2W sekose), rodantį audinių pokyčius, o histologiniai ir molekulinės biologijos tyrimai patvirtino radiologinio tyrimo rezultatus.
Šio eksperimento rezultatai rodo, kad NPE grupėje slankstelių kūno pažeidimo vietoje atsirado vizualinių ir histologinių pokyčių. Tuo pačiu metu buvo pastebėta IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų, taip pat IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų raiška, rodanti, kad autologinio branduolio minkštojo audinio pažeidimas slankstelių kūne gali sukelti daugybę signalinių ir morfologinių pokyčių. Nesunku pastebėti, kad gyvūnų modelio slankstelių kūnų signalinės charakteristikos (silpnas signalas T1W sekoje, mišrus signalas ir silpnas signalas T2W sekoje) yra labai panašios į žmogaus slankstelių ląstelių, o MRT charakteristikos taip pat patvirtina histologijos ir bendros anatomijos stebėjimus, t. y., slankstelių kūno ląstelių pokyčiai yra progresuojantys. Nors ūminės traumos sukeltas uždegiminis atsakas gali pasireikšti netrukus po punkcijos, MRT rezultatai parodė, kad progresyviai didėjantys signalo pokyčiai atsirado praėjus 12 savaičių po punkcijos ir išliko iki 20 savaičių be jokių atsigavimo ar MRT pokyčių panaikinimo požymių. Šie rezultatai rodo, kad autologinė stuburo NP yra patikimas metodas progresuojančiai MV nustatyti triušiams.
Šis punkcijos modelis reikalauja tinkamų įgūdžių, laiko ir chirurginių pastangų. Preliminarių eksperimentų metu, atlikus paravertebralinių raiščių struktūrų išpjovimą arba per didelį stimuliavimą, gali susidaryti slankstelių osteofitai. Reikia stengtis nepažeisti ir nesudirginti gretimų diskų. Kadangi norint gauti nuoseklius ir atkuriamus rezultatus, reikia kontroliuoti įsiskverbimo gylį, rankiniu būdu pagaminome kamštį, nupjaudami 3 mm ilgio adatos apvalkalą. Šio kamščio naudojimas užtikrina vienodą gręžimo gylį slankstelio kūne. Preliminarių eksperimentų metu trys operacijoje dalyvavę ortopedai chirurgai nustatė, kad su 16 kalibro adatomis lengviau dirbti nei su 18 kalibro adatomis ar kitais metodais. Siekiant išvengti per didelio kraujavimo gręžimo metu, adatos palaikymas kurį laiką nejuda, bus tinkamesnė įdėjimo anga, o tai rodo, kad tokiu būdu galima kontroliuoti tam tikrą MC laipsnį.
Nors atlikta daug tyrimų, skirtų MC, apie MC etiologiją ir patogenezę žinoma mažai25,26,27. Remdamiesi ankstesniais tyrimais, nustatėme, kad autoimunitetas vaidina pagrindinį vaidmenį MC12 atsiradime ir vystymesi. Šiame tyrime buvo nagrinėjama kiekybinė IL-4, IL-17 ir IFN-γ, kurie yra pagrindiniai CD4+ ląstelių diferenciacijos keliai po antigeno stimuliacijos, raiška. Mūsų tyrime, palyginti su neigiama grupe, NPE grupėje buvo didesnė IL-4, IL-17 ir IFN-γ raiška, o IL-4 ir IL-17 baltymų kiekiai taip pat buvo didesni.
Kliniškai IL-17 mRNR raiška padidėja pacientų, sergančių disko išvarža, NP ląstelėse28. Padidėjęs IL-4 ir IFN-γ raiškos lygis taip pat nustatytas ūminio nekompresinio disko išvaržos modelyje, palyginti su sveikais kontroliniais asmenimis29. IL-17 vaidina pagrindinį vaidmenį uždegime, audinių pažeidimuose autoimuninėse ligose30 ir sustiprina imuninį atsaką į IFN-γ31. Padidėjęs IL-17 sukeltas audinių pažeidimas buvo pastebėtas MRL/lpr pelėms32 ir autoimunitetui jautrioms pelėms33. IL-4 gali slopinti uždegimą skatinančių citokinų (tokių kaip IL-1β ir TNFα) raišką ir makrofagų aktyvaciją34. Buvo pranešta, kad IL-4 mRNR raiška NPE grupėje skyrėsi, palyginti su IL-17 ir IFN-γ tuo pačiu laiko momentu; IFN-γ mRNR raiška NPE grupėje buvo žymiai didesnė nei kitose grupėse. Todėl IFN-γ gamyba gali būti NP interkaliacijos sukelto uždegiminio atsako tarpininkė. Tyrimai parodė, kad IFN-γ gamina keli ląstelių tipai, įskaitant aktyvuotas 1 tipo pagalbines T ląsteles, natūralias žudikes ląsteles ir makrofagus35,36, ir yra pagrindinis uždegimą skatinantis citokinas, skatinantis imuninį atsaką37.
Šis tyrimas rodo, kad autoimuninis atsakas gali būti susijęs su MC atsiradimu ir vystymusi. Luoma ir kt. nustatė, kad MC ir ryškios NP signalo charakteristikos MRT tyrimuose yra panašios, ir abu rodo aukštą signalą T2W sekoje38. Patvirtinta, kad kai kurie citokinai, pavyzdžiui, IL-139, yra glaudžiai susiję su MC atsiradimu. Ma ir kt. teigė, kad NP iškilimas į viršų arba žemyn gali turėti didelę įtaką MC12 atsiradimui ir vystymuisi. Bobechko40 ir Herzbein ir kt.41 pranešė, kad NP yra imunotolerantiškas audinys, kuris negali patekti į kraujagyslių kraujotaką nuo gimimo. NP iškilimai į kraują įveda svetimkūnius, taip sukeldami vietines autoimunines reakcijas42. Autoimuninės reakcijos gali sukelti daugybę imuninių veiksnių, o kai šie veiksniai nuolat veikia audinius, jie gali sukelti signalizacijos pokyčius43. Šiame tyrime IL-4, IL-17 ir IFN-γ perteklinė raiška yra tipiški imuniniai veiksniai, dar labiau įrodantys glaudų NP ir MC ryšį44. Šis gyvūnų modelis gerai imituoja NP proveržį ir patekimą į galinę plokštelę. Šis procesas dar labiau atskleidė autoimuniteto poveikį MC.
Kaip ir tikėtasi, šis gyvūnų modelis suteikia mums galimą platformą MC tyrimams. Tačiau šis modelis vis dar turi tam tikrų apribojimų: pirma, gyvūnų stebėjimo fazės metu kai kuriuos tarpinės stadijos triušius reikia užmigdyti histologiniams ir molekulinės biologijos tyrimams, todėl laikui bėgant kai kurie gyvūnai „nebenaudojami“. Antra, nors šiame tyrime nustatyti trys laiko taškai, deja, modeliavome tik vieną MC tipą (Modic I tipo pokyčius), todėl to nepakanka, kad būtų galima pavaizduoti žmogaus ligos vystymosi procesą, ir reikia nustatyti daugiau laiko taškų, kad būtų galima geriau stebėti visus signalo pokyčius. Trečia, audinių struktūros pokyčius iš tiesų galima aiškiai parodyti histologiniu dažymu, tačiau kai kurie specializuoti metodai gali geriau atskleisti mikrostruktūrinius pokyčius šiame modelyje. Pavyzdžiui, poliarizuotos šviesos mikroskopija buvo naudojama fibrokremzlės formavimuisi triušių tarpslanksteliniuose diskuose analizuoti45. Ilgalaikis NP poveikis MC ir galinei plokštelei reikalauja tolesnių tyrimų.
Penkiasdešimt keturi Naujosios Zelandijos baltieji triušiai patinai (svoris apie 2,5–3 kg, amžius 3–3,5 mėn.) buvo atsitiktinai suskirstyti į fiktyvių operacijų grupę, raumenų implantacijos grupę (ME grupė) ir nervų šaknelių implantacijos grupę (NPE grupė). Visas eksperimentines procedūras patvirtino Tiandzino ligoninės etikos komitetas, o eksperimentiniai metodai buvo atliekami griežtai laikantis patvirtintų gairių.
S. Sobajimos chirurginė technika buvo šiek tiek patobulinta46. Kiekvienas triušis buvo paguldytas ant šono, ir penkių iš eilės juosmens tarpslankstelinių diskų (IVD) priekinis paviršius buvo atidengtas, naudojant posterolateralinį retroperitoninį metodą. Kiekvienam triušiui buvo taikoma bendroji nejautra (20 % uretano, 5 ml/kg per ausies veną). Nuo apatinio šonkaulių krašto iki dubens krašto, 2 cm atstumu ventrališkai nuo paravertebralinių raumenų, buvo padarytas išilginis odos pjūvis. Dešinysis anterolateralinis stuburas nuo L1 iki L6 buvo atidengtas aštriai ir buku viršutinio poodinio audinio, retroperitoninio audinio ir raumenų išpjovimu (6A pav.). Disko lygis buvo nustatytas naudojant dubens kraštą kaip anatominį orientyrą L5-L6 disko lygiui. 16 kalibro punkcijos adata išgręžkite 3 mm gylio skylę šalia L5 slankstelio galinės plokštelės (6B pav.). 5 ml švirkštu išsiurbkite autologinį branduolį pulposus L1-L2 tarpslanksteliniame diske (6C pav.). Pašalinkite branduolį pulposus arba raumenį pagal kiekvienos grupės reikalavimus. Pagilinus gręžtinę skylę, ant giliosios fascijos, paviršinės fascijos ir odos uždedami tirpstantys siūlai, operacijos metu stengiantis nepažeisti slankstelio kūno antkaulio audinio.
(A) L5–L6 diskas atidengiamas posterolateraliniu retroperitoniniu metodu. (B) 16 kalibro adata išgręžiama skylė šalia L5 galinės plokštelės. (C) Surenkamos autologinės MF.
Bendroji nejautra buvo taikoma 20 % uretano tirpalu (5 ml/kg), suleidžiamu į ausies veną, o juosmens stuburo rentgenogramos buvo pakartotos 12, 16 ir 20 savaičių po operacijos.
Triušiai buvo numarinti suleidus į raumenis ketamino (25,0 mg/kg) ir į veną natrio pentobarbitalio (1,2 g/kg) praėjus 12, 16 ir 20 savaičių po operacijos. Visas stuburas buvo pašalintas histologinei analizei ir atlikta tikroji analizė. Imuninių faktorių pokyčiams nustatyti buvo naudojama kiekybinė atvirkštinė transkripcija (RT-kPGR) ir Western blotavimas.
Triušiams MRT tyrimai buvo atlikti naudojant 3,0 T klinikinį magnetą („GE Medical Systems“, Florencija, Pietų Karolina) su ortogonaliu galūnės ritės imtuvu. Triušiai buvo anestezuoti 20 % uretanu (5 ml/kg) per ausies veną ir paguldyti ant nugaros magnete, juosmens sritį centruojant ant 5 colių skersmens apskritos paviršiaus ritės („GE Medical Systems“). Buvo gauti vainikiniai T2 svertiniai lokalizatoriaus vaizdai (TR, 1445 ms; TE, 37 ms), siekiant nustatyti juosmens disko vietą nuo L3–L4 iki L5–L6. Sagitalinės plokštumos T2 svertiniai pjūviai buvo gauti naudojant šiuos nustatymus: greita sukinio aidėjimo seka, kurios pasikartojimo laikas (TR) – 2200 ms, o aidėjimo laikas (TE) – 70 ms, matrica; regėjimo laukas – 260 ir aštuoni dirgikliai; pjovimo storis – 2 mm, tarpas – 0,2 mm.
Padarius paskutinę nuotrauką ir nugaišus paskutinį triušį, kontrolinis, į raumenis įterptas ir NP diskai buvo išimti histologiniam tyrimui. Audiniai buvo fiksuoti 10 % neutraliame buferiniame formaline 1 savaitę, dekalcifikuoti etilendiamintetraacto rūgštimi ir supjaustyti parafinu. Audinių blokai buvo įterpti į parafiną ir mikrotomu supjaustyti sagitaliniais pjūviais (5 μm storio). Pjūviai buvo dažomi hematoksilinu ir eozinu (H&E).
Surinkus tarpslankstelinius diskus iš kiekvienos grupės triušių, bendra RNR buvo išskirta naudojant UNIQ-10 kolonėlę („Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd.“, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas ir atvirkštinės transkripcijos sistemą „ImProm II“ („Promega Inc.“, Madisonas, Viskonsinas, JAV). Buvo atlikta atvirkštinė transkripcija.
RT-kPGR buvo atlikta naudojant „Prism 7300“ („Applied Biosystems Inc.“, JAV) ir „SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix“ („Sigma-Aldrich“, Sent Luisas, Misūris, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. PGR reakcijos tūris buvo 20 μl ir joje buvo po 1,5 μl praskiestos kDNR ir 0,2 μM kiekvieno pradmens. Pradmenis sukūrė „OligoPerfect Designer“ („Invitrogen“, Valensija, Kalifornija), o pagamino „Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd.“ (Kinija) (1 lentelė). Buvo naudojamos šios terminio ciklavimo sąlygos: pradinis polimerazės aktyvinimo etapas 94 °C temperatūroje 2 min., tada 40 ciklų po 15 s 94 °C temperatūroje šablono denatūravimui, atkaitinimas 1 min. 60 °C temperatūroje, ekstenzija ir fluorescencija. Matavimai buvo atlikti 1 min. 72 °C temperatūroje. Visi mėginiai buvo amplifikuoti tris kartus, o vidutinė vertė buvo naudojama RT-kPGR analizei. Amplifikacijos duomenys buvo analizuojami naudojant „FlexStation 3“ („Molecular Devices“, Sunnyvale, CA, JAV). IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų raiška buvo normalizuota pagal endogeninę kontrolę (ACTB). Santykiniai tikslinės mRNR raiškos lygiai buvo apskaičiuoti naudojant 2-ΔΔCT metodą.
Bendras baltymų kiekis iš audinių buvo išskirtas audinių homogenizatoriumi RIPA lizės buferyje (kuriame buvo proteazės ir fosfatazės inhibitorių kokteilis), o po to centrifuguotas 13 000 aps./min. greičiu 20 min. 4 °C temperatūroje, siekiant pašalinti audinių nuosėdas. Į kiekvieną juostą buvo įkelta penkiasdešimt mikrogramų baltymų, atskirta 10 % SDS-PAGE metodu ir perkelta ant PVDF membranos. Blokavimas buvo atliktas 5 % neriebaus pieno miltelių Tris buferiniame tirpale (TBS), kuriame yra 0,1 % Tween 20, 1 val. kambario temperatūroje. Membrana buvo inkubuojama su triušio antidekorino pirminiu antikūnu (praskiedimu 1:200; „Boster“, Uhanas, Kinija) (praskiedimu 1:200; „Bioss“, Pekinas, Kinija) per naktį 4 °C temperatūroje ir antrą dieną reagavo su antriniu antikūnu (ožkos anti-triušio imunoglobulinu G, praskiedimu santykiu 1:40 000) kartu su krienų peroksidaze („Boster“, Uhanas, Kinija) 1 val. kambario temperatūroje. Western bloto signalai buvo aptikti padidėjusia chemiluminescencija ant chemiluminescencinės membranos po rentgeno spindulių apšvitinimo. Densitometrinei analizei blotai buvo nuskaityti ir kiekybiškai įvertinti naudojant „BandScan“ programinę įrangą, o rezultatai išreikšti kaip tikslinio geno imunoreaktyvumo ir tubulino imunoreaktyvumo santykis.
Statistiniai skaičiavimai atlikti naudojant SPSS16.0 programinės įrangos paketą (SPSS, JAV). Tyrimo metu surinkti duomenys išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (vidurkis ± SD) ir analizuoti naudojant vienfaktorinę kartotinių matavimų dispersinę analizę (ANOVA), siekiant nustatyti skirtumus tarp dviejų grupių. P < 0,05 buvo laikoma statistiškai reikšminga.
Taigi, gyvūnų MC modelio sukūrimas implantuojant autologines NP į slankstelio kūną ir atliekant makroanatominį stebėjimą, MRT analizę, histologinį įvertinimą ir molekulinę biologinę analizę, gali tapti svarbia priemone vertinant ir suprantant žmogaus MC mechanizmus bei kuriant naujas terapines intervencijas.
Kaip cituoti šį straipsnį: Han, C. ir kt. Modicinių pokyčių gyvūnų modelis buvo sukurtas implantuojant autologinį branduolį pulposus į juosmens slankstelių subchondrinį kaulą. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. ir Boos, N. Juosmens slankstelių magnetinio rezonanso tomografija: disko išvaržos ir užsilaikymo, nervų šaknelių suspaudimo, galinės plokštelės anomalijų ir briauninio sąnario osteoartrito paplitimas besimptomiams savanoriams. Radiologija 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS ir Leboeuf-Eed, K. Modiniai pokyčiai ir jų ryšys su klinikiniais duomenimis. „European Spine Journal“: oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijų draugijos ir Europos kaklo stuburo tyrimų draugijos leidinys, 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. ir kt. Modiniai juosmens slankstelių galinių plokštelių pokyčiai: paplitimas ir ryšys su juosmens skausmu ir išialgija vidutinio amžiaus vyrams. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. ir Dalinka, M. Kaulų čiulpų pokyčių šalia galinės plokštelės MRT tyrimas juosmens slankstelių degeneracinės ligos atveju. AJR. „American Journal of Radiology“ 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ ir Carter, JR Degeneracinė disko liga: stuburo čiulpų pokyčių įvertinimas MRT. Radiologija 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS ir Carter, JR. Degeneracinės disko ligos vaizdinimas. Radiologija 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS ir kt. Neovertebralinės galinės plokštelės (Modic) signalo pokyčių prognozavimo veiksniai bendrojoje populiacijoje. Europos stuburo žurnalas: oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijų draugijos ir Europos kaklo stuburo tyrimų draugijos leidinys, 19 skyrius, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB ir Mannisch, K. Modiniai pokyčiai po juosmens disko išvaržos. „European Spine Journal“: oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijų draugijos ir Europos kaklo stuburo tyrimų draugijos leidinys, 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. ir Kaapa, E. Modiniai I tipo pokyčiai gali numatyti sparčiai progresuojančią deformacinę disko degeneraciją: 1 metų perspektyvinis tyrimas. „European Spine Journal“ 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ ir Fan, SW. Modiniai pokyčiai: galimos juosmens disko degeneracijos priežastys ir įtaka. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV. Vidinio disko plyšimas. Disko prolapso problemos, vyresniems nei 50 metų. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Įrašo laikas: 2024 m. gruodžio 13 d.