Dėkojame, kad apsilankėte gamtoje.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Norėdami gauti geriausius rezultatus, mes rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, mes rodysime svetainę be „Styles“ ir „JavaScript“.
Gyvūnų modelių modelių sukūrimas (MC) yra svarbus pagrindas tiriant MC. Penkiasdešimt keturi Naujosios Zelandijos balti triušiai buvo suskirstyti į fiktyvių operacijų grupę, raumenų implantacijos grupę (ME grupę) ir branduolio pulposo implantacijos grupę (NPE grupė). NPE grupėje tarpslankstelinis diskas buvo veikiamas priešakinio juosmens chirurginio metodo, o adata buvo naudojama L5 slankstelio korpusui pradurti šalia galinės plokštelės. NP iš L1/2 tarpslankstelinio disko buvo išgautas švirkštu ir į jį įšvirkščiamas. Gręžiant skylę subchondraliniame kaule. Chirurginės procedūros ir gręžimo metodai raumenų implantacijos grupėje ir fiktyvios operacijos grupėje buvo tokios pačios kaip ir NP implantacijos grupėje. ME grupėje į skylę buvo įdėtas raumenų gabalas, o fiktyviosios operacijos grupėje niekas nebuvo įdėtas į skylę. Po operacijos buvo atlikti MRT skenavimas ir molekuliniai biologiniai tyrimai. Signalas NPE grupėje pasikeitė, tačiau fiktyviosios operacijos grupės ir ME grupės akivaizdaus signalo pokyčio nebuvo. Histologinis stebėjimas parodė, kad IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija buvo pastebėta nenormalus audinių dauginimasis, o IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija padidėjo NPE grupėje. NP implantacija į subchondralinį kaulą gali sudaryti gyvūno MC modelį.
Modiniai pokyčiai (MC) yra slankstelių galinių plokščių ir gretimų kaulų čiulpų pažeidimai, matomi magnetinio rezonanso tomografijoje (MRT). Jie yra gana paplitę asmenims, sergantiems susijusiais simptomais1. Daugelis tyrimų pabrėžė MC svarbą dėl jo ryšio su apatinės nugaros dalies skausmais (LBP) 2,3. De Roos ir kt. 4 ir Modic et al.5 Savarankiškai pirmiausia aprašė tris skirtingų tipų subchondralinius signalo anomalijas slankstelių kaulų čiulpuose. I tipo I tipo pokyčiai yra hipointensyvi T1 svertinės (T1W) sekos ir hiperintensyvios T2 svertinės (T2W) sekos. Šis pažeidimas atskleidžia įtrūkimų galines plokšteles ir gretimą kraujagyslių granuliacijos audinį kaulų čiulpuose. II tipo pakeitimai rodo aukštą signalą tiek T1W, tiek T2W sekose. Tokio tipo pažeidimuose galima rasti galutinės plokštelės sunaikinimą, taip pat histologinį riebalų keitimą gretimų kaulų čiulpų pakeitimas. III tipo pakeitimai rodo žemą signalą T1W ir T2W sekose. Sklerotiniai pažeidimai, atitinkantys galines plokšteles, buvo pastebėti6. MC yra laikoma patologine stuburo liga ir yra glaudžiai susijusi su daugeliu degeneracinių stuburo ligų7,8,9 ligų.
Atsižvelgiant į turimus duomenis, keli tyrimai pateikė išsamias įžvalgas apie MC etiologijos ir patologinius mechanizmus. Albertas ir kt. pasiūlė, kad MC gali sukelti disko išvarža8. Hu ir kt. priskyrė MC sunkios disko degeneracijai10. KROC pasiūlė „vidinio disko plyšimo“ sąvoką, kurioje teigiama, kad pasikartojanti disko trauma gali sukelti mikroelementų galinėje plokštelėje. Po plyšio susidarymo, branduolio pulposo (NP) sunaikinimas iš galutinės plokštelės gali sukelti autoimuninį atsaką, kuris dar labiau lemia MC11 vystymąsi. Ma ir kt. Dalijosi panašiu požiūriu ir pranešė, kad NP sukeltas autoimunitetas vaidina pagrindinį vaidmenį MC12 patogenezėje.
Imuninės sistemos ląstelės, ypač CD4+ T pagalbininkai limfocitai, vaidina svarbų vaidmenį automatinio autoimuniteto13 patogenezėje. Neseniai aptiktas Th17 pogrupis sukuria priešuždegiminį citokino IL-17, skatina chemokinų ekspresiją ir skatina T ląsteles pažeistuose organuose gaminti IFN-γ14. Th2 ląstelės taip pat vaidina unikalų vaidmenį imuninių reakcijų patogenezėje. IL-4, kaip reprezentatyvios Th2 ląstelių, ekspresija gali sukelti sunkias imunopatologines pasekmes15.
Nors buvo atlikta daugybė klinikinių tyrimų su MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, vis dar trūksta tinkamų eksperimentinių modelių gyvūnams, kurie gali imituoti MC procesą, kuris dažnai vyksta žmonėms ir gali būti Naudojamas tiriant etiologiją ar naujus gydymo būdus, tokius kaip tikslinė terapija. Iki šiol buvo pranešta, kad tik keli gyvūnų MC modeliai tiria pagrindinius patologinius mechanizmus.
Remiantis Alberto ir MA pasiūlyta autoimunine teorija, šis tyrimas nustatė paprastą ir atkuriamą triušio MC modelį, naudojant autotransplantaciją NP šalia išgręžtos slankstelių galinės plokštės. Kiti tikslai yra stebėti gyvūnų modelių histologines savybes ir įvertinti specifinius NP mechanizmus kuriant MC. Šiuo tikslu mes naudojame tokius metodus kaip molekulinė biologija, MRT ir histologiniai tyrimai, norėdami ištirti MC progresavimą.
Du triušiai mirė nuo kraujavimo operacijos metu, o MRT metu anestezijos metu mirė keturi triušiai. Likę 48 triušiai išgyveno ir po operacijos neparodė jokių elgesio ar neurologinių požymių.
MRT rodo, kad įterpto audinio signalo intensyvumas skirtingose skylėse yra skirtingas. L5 slankstelio korpuso signalo intensyvumas NPE grupėje pamažu pasikeitė praėjus 12, 16 ir 20 savaičių po įterpimo (T1W seka parodė žemą signalą, o T2W seka parodė mišrų signalą ir žemą signalą) (1 pav. C), o MRT išvaizdos - MRT iš esmės Iš kitų dviejų įterptųjų dalių grupių tuo pačiu laikotarpiu išliko santykinai stabilios (1A pav., B).
(A) Triušio juosmens stuburo reprezentacinis nuoseklusis MRT 3 laiko momentais. Fiktyvios operacijos grupės vaizduose nerasta jokių signalo anomalijų. (B) Slankstelio kūno signalo charakteristikos ME grupėje yra panašios į fiktyvių operacijų grupės, o laikui bėgant įterpimo vietoje reikšmingų signalų pokyčių nepastebėta. (C) NPE grupėje žemas signalas yra aiškiai matomas T1W sekoje, o mišrus signalas ir žemas signalas yra aiškiai matomi T2W sekoje. Nuo 12 savaičių iki 20 savaičių laikotarpio mažėja sporadiniai dideli signalai, supantys žemus signalus T2W sekoje.
Akivaizdi kaulų hiperplazija gali būti matoma NPE grupės slankstelių kūno implantacijos vietoje, o kaulų hiperplazija įvyksta greičiau nuo 12 iki 20 savaičių (2c pav.), Palyginti su NPE grupe, modeliuojamoje slanksteliuose reikšmingų pokyčių nepastebėta jokių reikšmingų pokyčių. kūnai; „Sham Group“ ir „Me Group“ (2C pav.) 2A, B).
A) Slankstelio kūno paviršius, esančio implantuotos dalyje, yra labai lygus, skylė gerai gydo, o slankstelio kūne nėra hiperplazijos. (B) Implantuojamos vietos ME grupėje forma yra panaši į fiktyvios operacijų grupės, ir laikui bėgant implantuotos vietos atsiradimas nėra akivaizdus. (C) Kaulų hiperplazija įvyko Implantuojamoje vietoje NPE grupėje. Kaulų hiperplazija greitai padidėjo ir netgi išplėsta per tarpslankstelinį diską iki priešingo slankstelių kūno.
Histologinė analizė suteikia išsamesnės informacijos apie kaulų formavimąsi. 3 paveiksle pavaizduotos pooperacinių skyrių, dažytų H&E, nuotraukos. Fiktyviosios operacijos grupėje chondrocitai buvo gerai išdėstyti ir ląstelių proliferacija nebuvo nustatyta (3A pav.). Padėtis ME grupėje buvo panaši į fiktyviosios operacijos grupės (3b pav.). Tačiau NPE grupėje implantacijos vietoje buvo pastebėta daugybė chondrocitų ir į NP panašių ląstelių dauginimąsi (3c pav.);
(A) Trabekula gali būti matoma šalia galinės plokštelės, chondrocitai yra tvarkingai išdėstyti su vienodu ląstelių dydžiu ir forma ir be proliferacijos (40 kartų). (B) Implantacijos vietos būklė ME grupėje yra panaši į fiktyvios grupės. Trabeculae ir chondrocitai gali būti matomi, tačiau implantacijos vietoje (40 kartų) nėra akivaizdaus dauginimosi. (B) Galima pastebėti, kad chondrocitai ir į NP panašios ląstelės žymiai dauginasi, o chondrocitų forma ir dydis yra nevienodi (40 kartų).
Interleukino 4 (IL-4) mRNR, interleukino 17 (IL-17) mRNR ir interferono γ (IFN-γ) mRNR raiška buvo pastebėta tiek NPE, tiek ME grupėse. Palyginus tikslinių genų ekspresijos lygius, NPE grupėje reikšmingai padidėjo IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų išraiškos, palyginti su ME grupės ir fiktyvių operacijų grupės (4 pav.) (4 pav.) (4 pav.). (P <0,05). Palyginti su fiktyvių operacijų grupe, IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresijos lygiai ME grupėje tik šiek tiek padidėjo ir nepasiekė statistinių pokyčių (p> 0,05).
IL-4, IL-17 ir IFN-γ mRNR raiška NPE grupėje parodė žymiai didesnę tendenciją nei „Sham“ operacijų grupėje ir ME grupėje (P <0,05).
Priešingai, išraiškos lygiai ME grupėje reikšmingo skirtumo neparodė (P> 0,05).
Western blot analizė buvo atlikta naudojant komerciškai prieinamus antikūnus prieš IL-4 ir IL-17, siekiant patvirtinti pakitusią mRNR ekspresijos modelį. Kaip parodyta 5a, B paveiksluose, palyginti su ME grupe ir fiktyvi operacijų grupe, IL-4 ir IL-17 baltymų lygis NPE grupėje žymiai padidėjo (P <0,05). Palyginti su fiktyviosios operacijos grupe, IL-4 ir IL-17 baltymų lygis ME grupėje taip pat nepasiekė statistiškai reikšmingų pokyčių (P> 0,05).
(A) IL-4 ir IL-17 baltymų lygis NPE grupėje buvo žymiai didesnis nei ME ir placebo grupės (P <0,05). B) Western blot histograma.
Dėl riboto žmogaus mėginių, gautų operacijos metu, skaičius, aiškūs ir išsamūs MC patogenezės tyrimai yra šiek tiek sunkūs. Mes bandėme sukurti gyvūno MC modelį, kad ištirtume jo galimus patologinius mechanizmus. Tuo pačiu metu buvo naudojamas radiologinis įvertinimas, histologinis įvertinimas ir molekulinio biologinis įvertinimas, siekiant sekti NP autografo sukeltą MC eigą. Dėl to NP implantacijos modelis lėmė, kad signalo intensyvumas laipsniškai pasikeitė nuo 12 savaičių iki 20 savaičių laiko (mišrus žemas signalas T1W sekose ir žemas signalas T2W sekose), tai rodo audinių pokyčius ir histologinį ir molekulinį Biologiniai vertinimai patvirtino radiologinio tyrimo rezultatus.
Šio eksperimento rezultatai rodo, kad vaizdiniai ir histologiniai pokyčiai įvyko slankstelių kūno pažeidimo vietoje NPE grupėje. Tuo pačiu metu buvo pastebėta IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų, taip pat IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija, tai rodo, kad autologinio branduolio pulposus audinio pažeidimas slanksteliuose Kūnas gali sukelti daugybę signalo ir morfologinių pokyčių. Nesunku pastebėti, kad gyvūno modelio slankstelių kūnų signalo charakteristikos (žemas signalas T1W sekoje, mišrus signalas ir žemas signalas T2W sekoje) yra labai panašūs į žmogaus slankstelių ląsteles, taip pat ir MRT charakteristikos. Patvirtinkite histologijos ir bendrosios anatomijos stebėjimus, tai yra, slankstelių kūno ląstelių pokyčiai yra progresyvūs. Nors ūminės traumos sukeltas uždegiminis atsakas gali atsirasti netrukus po pradūrimo, MRT rezultatai parodė, kad laipsniškai didėjantys signalo pokyčiai atsirado per 12 savaičių po pradūrimo ir išliko iki 20 savaičių be jokių MRT pokyčių pasveikimo ar pasikeitimo požymių. Šie rezultatai rodo, kad autologinis slankstelių NP yra patikimas metodas, kaip nustatyti progresyvų MV triušiuose.
Šis punkcijos modelis reikalauja tinkamų įgūdžių, laiko ir chirurginių pastangų. Preliminariuose eksperimentuose išpjaustymo ar per didelis paravertebralinių raiščių struktūrų stimuliavimas gali sukelti slankstelių osteofitus. Reikėtų pasirūpinti, kad nesugadintų ir nedirgintų gretimų diskų. Kadangi skverbimosi gylis turi būti kontroliuojamas, kad būtų gauti nuoseklūs ir atkuriami rezultatai, mes rankiniu būdu padarėme kištuką, nukirpdami 3 mm ilgio adatos apvalkalą. Naudojant šį kištuką, užtikrinamas vienodas gręžimo gylis slankstelio korpuse. Preliminariuose eksperimentuose trys ortopedijos chirurgai, dalyvavę operacijoje, nustatė, kad 16 dydžių adatos lengviau dirbti su nei 18 dydžių adatomis ar kitais būdais. Norėdami išvengti per didelio kraujavimo gręžimo metu, kurį laiką laikant adatą, ji suteiks tinkamesnę įterpimo angą, o tai rodo, kad tokiu būdu gali būti kontroliuojamas tam tikras MC laipsnis.
Nors daugelis tyrimų buvo nukreipti į MC, mažai žinoma apie MC25,26,27 etiologiją ir patogenezę. Remdamiesi ankstesniais tyrimais, mes nustatėme, kad autoimunitetas vaidina pagrindinį vaidmenį MC12 atsiradime ir vystymosi metu. Šiame tyrime buvo tiriama kiekybinė IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija, kurie yra pagrindiniai CD4+ ląstelių diferenciacijos keliai po antigeno stimuliacijos. Mūsų tyrime, palyginti su neigiama grupe, NPE grupėje buvo didesnė IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija, o IL-4 ir IL-17 baltymų lygis taip pat buvo didesnis.
Kliniškai IL-17 mRNR raiška padidėja pacientų, sergančių disko išvarža28, NP ląstelėse. Padidėjęs IL-4 ir IFN-γ ekspresijos lygis taip pat buvo nustatytas ūmiame ne kompresinio disko išvaržos modelyje, palyginti su sveikais kontroliniais 29. IL-17 vaidina pagrindinį vaidmenį uždegant, audinių sužalojimą sergant autoimuninėmis ligomis30 ir sustiprina imuninį atsaką į IFN-γ31. Buvo pranešta apie padidėjusį IL-17 tarpininkaujamą audinių sužalojimą MRL/LPR MICE32 ir autoimuniteto jautrioms pelėms33. IL-4 gali slopinti priešuždegiminių citokinų (tokių kaip IL-1β ir TNFα) ir makrofagų aktyvacijos34 ekspresiją. Buvo pranešta, kad IL-4 mRNR raiška NPE grupėje buvo skirtingi, palyginti su IL-17 ir IFN-γ tuo pačiu metu; IFN-γ mRNR raiška NPE grupėje buvo žymiai didesnė nei kitose grupėse. Todėl IFN-γ gamyba gali būti uždegiminio atsako tarpininkas, kurį sukelia NP interkalacija. Tyrimai parodė, kad IFN-γ gamina keliais ląstelių tipais, įskaitant aktyvuotas 1 tipo pagalbines T ląsteles, natūralias žudikių ląsteles ir makrofagus35,36, ir yra pagrindinis priešuždegiminis citokinas, skatinantis imuninį atsaką37.
Šis tyrimas rodo, kad autoimuninis atsakas gali būti susijęs su MC atsiradimu ir vystymuisi. Luoma ir kt. nustatė, kad MC ir iškilios NP signalo charakteristikos yra panašios MRT, ir abi rodo aukštą signalą T2W sekoje38. Buvo patvirtinta, kad kai kurie citokinai yra glaudžiai susiję su MC atsiradimu, pavyzdžiui, IL-139. Ma ir kt. pasiūlė, kad NP išsikišimas aukštyn arba žemyn gali turėti didelę įtaką MC12 atsiradimui ir vystymuisi. Bobechko40 ir Herzbein ir kt. NP iškyšos į kraujo tiekimą įveda svetimus kūnus, taip tarpininkaujant vietinėms autoimuninėms reakcijoms42. Autoimuninės reakcijos gali sukelti daugybę imuninių veiksnių, o kai šie veiksniai nuolat veikia audinius, jie gali sukelti signalizacijos pokyčius43. Šiame tyrime per didelis IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija yra tipiški imuniniai veiksniai, dar labiau įrodantys artimą NP ir MCS44 ryšį. Šis gyvūnų modelis gerai imituoja NP proveržį ir patekimą į galinę plokštelę. Šis procesas taip pat atskleidė autoimuniteto poveikį MC.
Kaip ir tikėtasi, šis gyvūnų modelis suteikia mums galimybę studijuoti MC. Tačiau šis modelis vis dar turi tam tikrų apribojimų: pirma, gyvūnų stebėjimo fazės metu kai kuriuos vidutinės pakopos triušius reikia išnaikinti atliekant histologinius ir molekulinės biologijos tyrimus, todėl laikui bėgant kai kurie gyvūnai „nenaudojami“. Antra, nors šiame tyrime nustatyta trys laiko taškai, deja, mes modeliavome tik vieno tipo MC (I modio tipo keičiasi), todėl nepakanka parodyti žmonių ligos kūrimo procesą, ir reikia nustatyti daugiau laiko taškų Geriau stebėkite visus signalo pokyčius. Trečia, audinių struktūros pokyčius iš tikrųjų gali aiškiai parodyti histologinis dažymas, tačiau kai kurie specializuoti metodai gali geriau atskleisti šio modelio mikrostruktūrinius pokyčius. Pavyzdžiui, fibrocartilage susidarymas triušio tarpslanksteliniuose diskuose45 fibrocartilage išanalizavimui buvo naudojama poliarizuota šviesos mikroskopija. Ilgalaikiam NP poveikiui MC ir galinei plokštelei reikia toliau tirti.
Penkiasdešimt keturi Naujosios Zelandijos vyrai balti triušiai (svoris apie 2,5–3 kg, 3–3,5 mėnesio) atsitiktine tvarka buvo suskirstyti į fiktyvią operacijų grupę, raumenų implantacijos grupę (ME grupę) ir nervų šaknų implantacijos grupę (NPE grupė). Visas eksperimentines procedūras patvirtino Tianjino ligoninės etikos komitetas, o eksperimentiniai metodai buvo atlikti griežtai pagal patvirtintas gaires.
Buvo padaryta keletas S. Sobajima 46 chirurginės technikos patobulinimų. Kiekvienas triušis buvo dedamas į šoninę atsigavimo padėtį, o penkių iš eilės iš eilės juosmens tarpslankstelinių diskų (IVD) priekinis paviršius buvo eksponuojamas naudojant posterolateralinį retroperitoninį metodą. Kiekvienam triušiui buvo atlikta bendra anestezija (20% uretano, 5 ml/kg per ausies veną). Išilginis odos pjūvis buvo padarytas iš apatinio šonkaulių krašto iki dubens krašto, 2 cm vidurio į paravertebralinius raumenis. Dešinysis priešakinis stuburas nuo L1 iki L6 buvo paveiktas aštriu ir neryškiu viršutinio poodinio audinio, retroperitoninio audinio ir raumenų išpjaustymu (6A pav.). Disko lygis buvo nustatytas naudojant dubens kraštą kaip anatominį orientyrą L5-L6 disko lygiui. Norėdami išgręžti skylę šalia L5 slankstelio galinės plokštės, naudokite 16-ojo dydžio punkcijos adatą iki 3 mm gylio (6b pav.). Norėdami išsiurbti autologinį branduolio pulposą L1-L2 tarpslanksteliniame diske (6 pav. C), naudokite 5 ml švirkštą (6c pav.). Nuimkite branduolio pulposus ar raumenis pagal kiekvienos grupės reikalavimus. Gilus gręžimo angai, absorbuojamos siūlės dedamos ant gilios fascijos, paviršutiniškos fascijos ir odos, nesvarbu, kad operacijos metu reikia nepažeisti slankstelio kūno periostealinio audinio.
(A) L5 - L6 diskas yra veikiamas pagal posterolateralinį retroperitoninį metodą. B) Norėdami išgręžti skylę šalia L5 galinės plokštelės, naudokite 16 dydžių adatą. C) Autologiniai MF yra nuimami.
Bendroji anestezija buvo skiriama 20% uretano (5 ml/kg), skiriamo per ausies veną, o juosmens stuburo rentgenografija buvo pakartota 12, 16 ir 20 savaičių pooperaciniu būdu.
Triušiai buvo paaukoti atliekant intramuskulinį ketamino (25,0 mg/kg) ir intraveninio natrio pentobarbitalinio (1,2 g/kg) injekciją 12, 16, 16 ir 20 savaičių po operacijos. Visas stuburas buvo pašalintas histologinei analizei ir buvo atlikta reali analizė. Imuninių veiksnių pokyčiams nustatyti buvo naudojami kiekybinė atvirkštinė transkripcija (RT-QPCR) ir Western blot analizė.
MRT tyrimai buvo atlikti triušiuose, naudojant 3,0 T klinikinį magnetą (GE medicinos sistemos, Florence, SC), aprūpintas stačiakampiu galūnių ritės imtuvu. Triušiai buvo anestezuojami 20% uretano (5 ml/kg) per ausies veną, o po to buvo įdėta į magnetą, o juosmens sritis, kurios centre yra 5 colių skersmens apskrito paviršiaus ritė (GE medicinos sistemos). Koroniniai T2 svertiniai lokalizatoriaus vaizdai (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) buvo gauti, kad būtų galima apibrėžti juosmens disko vietą nuo L3-L4 iki L5-L6. Sagittalinė plokštuma T2 svertiniai griežinėliai buvo įgyti su šiais nustatymais: „Fast Spin-Echo“ seka su 2200 ms pakartojimo laiku (TR) ir 70 ms aido laikas (TE), matrica; regėjimo laukas 260 ir aštuoni dirgikliai; Pjovimo storis buvo 2 mm, tarpas buvo 0,2 mm.
Po to, kai buvo padaryta paskutinė nuotrauka ir nužudytas paskutinis triušis, histologiniam tyrimui buvo pašalinti fiktyviai, raumenys, įterpti ir NP diskai. Audiniai buvo fiksuoti 10% neutraliame buferiniame formaline 1 savaitę, dekalcializuoti etilendiaminetraacto rūgštimi, o parafinas - pjaustytas. Audinių blokai buvo įterpti į parafiną ir, naudojant mikrotomą, supjaustyti į sagitalines dalis (5 μm storio). Skyriai buvo nudažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E).
Surinkus kiekvienos grupės triušių tarpslankstelinius diskus, bendra RNR buvo išgaunama naudojant UNIQ-10 kolonėlę (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Kinija) pagal gamintojo instrukcijas ir eksprominę II atvirkštinės transkripcijos sistemos (Promega Inc. , Madison, WI, JAV). Atlikta atvirkštinė transkripcija.
RT-QPCR buvo atliktas naudojant „Prism 7300“ („Applied Biosystems Inc.“, JAV) ir „SYBR Green Jump Start TAQ Readymix“ (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. PGR reakcijos tūris buvo 20 μl ir jame buvo 1,5 μl praskiestos cDNR ir 0,2 μM kiekvieno grunto. Pradmenis suprojektavo „Oligoperfect“ dizaineris (Invitrogen, Valencia, CA) ir pagamino Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Kinija) (1 lentelė). Buvo naudojamos šios šiluminės ciklo sąlygos: pradinis polimerazės aktyvacijos žingsnis 24 ° C temperatūroje 2 minutes, po to 40 ciklų po 15 s, esant 94 ° C temperatūrai šablonui denatūracijai, atkaitinant 1 min. 60 ° C temperatūroje, pratęsimas ir fluorescencija. Matavimai buvo atlikti 1 min. 72 ° C temperatūroje. Visi mėginiai buvo amplifikuoti tris kartus, o vidutinė vertė buvo naudojama RT-QPCR analizei. Amplifikacijos duomenys buvo analizuojami naudojant „FlexStation 3“ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, JAV). IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų ekspresija buvo normalizuoti iki endogeninės kontrolės (ACTB). Tikslinės mRNR santykiniai išraiškos lygiai buvo apskaičiuoti naudojant 2-ΔΔCT metodą.
Bendras baltymai buvo išgauti iš audinių, naudojant audinių homogenizatorių RIPA lizės buferyje (kuriame yra proteazės ir fosfatazės inhibitoriaus kokteilis), o po to 20 minučių centrifuguojami esant 13 000 aps./min. Penkiasdešimt mikrogramų baltymų buvo pakrauti vienoje juostoje, atskirti 10% SDS-PAGE, o po to perkeliami į PVDF membraną. Blokavimas buvo atliktas 5% neriebaus sauso pieno TRIS buferiniame druskos tirpale (TBS), kuriame yra 0,1% Tween 20 1 valandą kambario temperatūroje. Membrana buvo inkubuota su triušio anti-dekorino pirminiu antikūnu (praskiesta 1: 200; Boster, Wuhan, Kinija) (praskiesta 1: 200; Bioss, Pekinas, Kinija) per naktį 4 ° C temperatūroje ir reagavo antrąsias dienas; su antriniu antikūnu (ožkos anti-triušio imunoglobulinas G 1: 40 000 skiedimo) kartu su krienų peroksidaze (Boster, Wuhan, Kinija) 1 valandą kambario temperatūroje. Western blot signalai buvo aptikti padidėjus chemiliuminescencijai chemiliuminescencinėje membranoje po rentgeno spinduliuotės. Atliekant densitometrinę analizę, blotai buvo nuskaitytos ir kiekybiškai įvertintos naudojant juostųSCAN programinę įrangą, o rezultatai buvo išreikšti kaip tikslinio geno imunoreaktyvumo ir tubulino imunoreaktyvumo santykis.
Statistiniai skaičiavimai buvo atlikti naudojant SPSS16.0 programinės įrangos paketą (SPSS, JAV). Tyrimo metu surinkti duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (vidurkis ± SD) ir analizuojami naudojant vienpusį pakartotinių variantų dispersijos analizę (ANOVA), siekiant nustatyti skirtumus tarp dviejų grupių. P <0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.
Taigi, sukuriant MC gyvūno modelį, implantuojant autologinius NPS į slankstelių kūną ir atliekant makroanatominį stebėjimą, MRT analizę, histologinį vertinimą ir molekulinę biologinę analizę gali tapti svarbia priemonė įvertinti ir suprasti žmogaus MC mechanizmus ir sukurti naują terapinę terapinę analizę Intervencijos.
Kaip cituoti šį straipsnį: Han, C. et al. Gyvūnų modelių pokyčių modelis buvo nustatytas implantuojant autologinį branduolio pulposą į juosmens stuburo subchondralinį kaulą. Sci. 6, 35102: 10.1038/SREP35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. ir Boos, N. Juosmens stuburo magnetinio rezonanso tomografija: disko išvaržos paplitimas ir susilaikymas, nervų šaknų suspaudimas, galinės plokštės anomalijos ir briaunų sąnarių osteoartritas asimptominiai savanoriai savanoriai. . įvertinti. Radiologija 209, 661–666, doi: 10.1148/radiologija.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS ir LeBoeuf-Eande, K. Modiniai pokyčiai ir jų ryšys su klinikiniais duomenimis. Europos stuburo žurnalas: Oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijos draugijos ir Europos gimdos kaklelio stuburo tyrimų draugijos leidinys 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. ir kt. Modiniai juosmens slankstelių galinių plokščių pokyčiai: paplitimas ir ryšys su apatinės nugaros skausmais ir išialgija vidutinio amžiaus vyrų darbuotojams. Stuburas 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. ir Dalinka, M. MRT Kaulų čiulpų MRT keičiasi prie galinės plokštelės, esant juosmens stuburo degeneracinei ligai. AJR. „American Journal of Radiology 149“, 531–534, doi: 10.2214/AJR.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ ir Carter, Jr degeneracinė disko liga: slankstelių čiulpų pokyčių įvertinimas naudojant MRT. Radiologija 166, 193–199, doi: 10.1148/radiologija.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS ir Carter, JR vaizduojant degeneracinę disko ligą. Radiologija 168, 177–186, doi: 10.1148/radiologija.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS ir kt. Nevertabralinio galinės plokštelės (Modic) signalo pokyčių prognozuotojai bendroje populiacijoje. Europos stuburo žurnalas: Oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijos draugijos ir Europos gimdos kaklelio stuburo tyrimų draugijos leidinys, 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albertas, HB ir Mannischas, K. Modiniai pokyčiai po juosmens disko išvaržos. Europos stuburo žurnalas: Oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijos draugijos ir Europos gimdos kaklelio stuburo tyrimų draugijos leidinys 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Fanmas, T., Gronblad, M. ir Kaapa, E. I Modic tipo pokyčiai gali numatyti greitai progresuojantį deformacijos disko degeneraciją: 1 metų perspektyvus tyrimas. Europos stuburo žurnalas 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
HU, ZJ, ZHAO, FD, FANG, XQ ir ventiliatorius, SW Modiniai pokyčiai: Galimos priežastys ir indėlis į juosmens disko degeneraciją. Medicinos hipotezės 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV vidinis disko plyšimas. Disko prolapsų problemos, vyresnės nei 50 metų. Stuburas (Phila PA 1976) 11, 650–653 (1986).
Pašto laikas: 2012 m. Gruodžio 13 d