Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Siekiant geriausių rezultatų, rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Modicinių pokyčių (MC) gyvūnų modelių sukūrimas yra svarbus MC tyrimo pagrindas. Penkiasdešimt keturi Naujosios Zelandijos baltieji triušiai buvo suskirstyti į fiktyvių operacijų grupę, raumenų implantavimo grupę (ME grupę) ir nucleus pulposus implantacijos grupę (NPE grupę). NPE grupėje tarpslankstelinis diskas buvo apnuogintas taikant priekinį šoninį juosmens chirurginį metodą ir adata buvo pradurta L5 slankstelio kūnas šalia galinės plokštės. NP buvo ištrauktas iš L1/2 tarpslankstelinio disko švirkštu ir sušvirkštas į jį. Skylės gręžimas subchondraliniame kaule. Chirurginės procedūros ir gręžimo metodai raumenų implantacijos grupėje ir fiktyvių operacijų grupėje buvo tokie patys kaip ir NP implantacijos grupėje. ME grupėje į skylę buvo įdėtas raumens gabalas, o fiktyvių operacijų grupėje nieko nebuvo įdėta į skylę. Po operacijos atliktas MRT skenavimas ir molekuliniai biologiniai tyrimai. NPE grupės signalas pasikeitė, tačiau fiktyvių operacijų grupėje ir ME grupėje nebuvo akivaizdžių signalo pokyčių. Histologinis stebėjimas parodė, kad implantacijos vietoje buvo pastebėtas nenormalus audinių proliferacija, o NPE grupėje padidėjo IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija. NP implantavimas į subchondrinį kaulą gali sudaryti gyvūnų MC modelį.
Modiniai pokyčiai (MC) yra slankstelių galinių plokštelių ir gretimų kaulų čiulpų pažeidimai, matomi magnetinio rezonanso tomografijoje (MRT). Jie gana dažni asmenims, turintiems susijusių simptomų1. Daugelis tyrimų pabrėžė MC svarbą dėl jo sąsajos su juosmens skausmu (LBP)2,3. de Roos et al.4 ir Modic et al.5 nepriklausomai pirmą kartą aprašė tris skirtingus subchondrinio signalo anomalijų tipus stuburo kaulų čiulpuose. Modiniai I tipo pokyčiai yra hipointensyvūs T1 svertinėse (T1W) sekose ir hiperintensyvūs T2 svertinėse (T2W) sekose. Šis pažeidimas atskleidžia plyšio galines plokšteles ir gretimus kraujagyslių granuliacinius audinius kaulų čiulpuose. Modiciniai II tipo pakeitimai rodo aukštą signalą tiek T1W, tiek T2W sekose. Esant tokio tipo pažeidimams, galima nustatyti galinės plokštelės sunaikinimą, taip pat histologinį gretimų kaulų čiulpų riebalų pakeitimą. Modiciniai III tipo pakeitimai rodo žemą signalą T1W ir T2W sekose. Buvo pastebėti sklerotiniai pažeidimai, atitinkantys galines plokšteles6. MC laikoma patologine stuburo liga ir yra glaudžiai susijusi su daugeliu degeneracinių stuburo ligų7,8,9.
Atsižvelgiant į turimus duomenis, keli tyrimai pateikė išsamių įžvalgų apie MC etiologiją ir patologinius mechanizmus. Albertas ir kt. pasiūlė, kad MC gali atsirasti dėl disko išvaržos8. Hu ir kt. MC priskyrė stipriai disko degeneracijai10. Kroc pasiūlė „vidinio disko plyšimo“ koncepciją, kuri teigia, kad pasikartojančios disko traumos gali sukelti mikroplyšimus galinėje plokštelėje. Po plyšio susidarymo galinės plokštelės sunaikinimas, kurį sukelia pulpos branduolys (NP), gali sukelti autoimuninį atsaką, kuris toliau lemia MC11 vystymąsi. Ma ir kt. laikėsi panašios nuomonės ir pranešė, kad NP sukeltas autoimunitetas vaidina pagrindinį vaidmenį MC12 patogenezėje.
Imuninės sistemos ląstelės, ypač CD4+ T pagalbiniai limfocitai, vaidina lemiamą vaidmenį autoimuniteto patogenezėje13. Neseniai atrastas Th17 pogrupis gamina priešuždegiminį citokiną IL-17, skatina chemokinų ekspresiją ir stimuliuoja pažeistų organų T ląsteles gaminti IFN-γ14. Th2 ląstelės taip pat atlieka unikalų vaidmenį imuninio atsako patogenezėje. IL-4, kaip reprezentacinės Th2 ląstelės, ekspresija gali sukelti sunkių imunopatologinių pasekmių15.
Nors buvo atlikta daug klinikinių tyrimų su MC16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, vis dar trūksta tinkamų eksperimentinių modelių su gyvūnais, kurie galėtų imituoti MC procesą, kuris dažnai pasireiškia žmonėms ir gali būti naudojamas tiriant etiologiją arba naujus gydymo būdus, tokius kaip tikslinė terapija. Iki šiol buvo pranešta, kad tik keli MC gyvūnų modeliai tiria pagrindinius patologinius mechanizmus.
Remiantis Alberto ir Ma pasiūlyta autoimunine teorija, šis tyrimas sukūrė paprastą ir atkuriamą triušio MC modelį, autotransplantuojant NP šalia išgręžtos stuburo galinės plokštės. Kiti tikslai yra stebėti gyvūnų modelių histologines charakteristikas ir įvertinti specifinius NP mechanizmus kuriant MC. Šiuo tikslu MC progresavimui tirti naudojame tokius metodus kaip molekulinė biologija, MRT ir histologiniai tyrimai.
Du triušiai mirė nuo kraujavimo operacijos metu, o keturi triušiai mirė anestezijos metu MRT metu. Likę 48 triušiai išgyveno ir po operacijos neturėjo jokių elgesio ar neurologinių požymių.
MRT rodo, kad skirtingose skylėse įterpto audinio signalo intensyvumas yra skirtingas. L5 slankstelio kūno signalo intensyvumas NPE grupėje palaipsniui keitėsi praėjus 12, 16 ir 20 savaičių po įdėjimo (T1W seka rodė žemą signalą, o T2W seka – mišrų signalą ir žemą signalą) (1C pav.), o MRT pasirodė. kitų dviejų įterptųjų dalių grupių per tą patį laikotarpį išliko gana stabilios (1A, B pav.).
(A) Reprezentatyvūs nuoseklūs triušio juosmens stuburo MRT 3 laiko taškais. Apgaulingos operacijos grupės nuotraukose jokių signalo nukrypimų nerasta. (B) ME grupės slankstelio kūno signalo charakteristikos yra panašios į fiktyvių operacijų grupės charakteristikas, ir laikui bėgant įterpimo vietoje nepastebėta jokių reikšmingų signalo pokyčių. (C) NPE grupėje žemas signalas aiškiai matomas T1W sekoje, o mišrus signalas ir žemas signalas yra aiškiai matomi T2W sekoje. Nuo 12 savaičių laikotarpio iki 20 savaičių periodiniai aukšti signalai, supantys žemus signalus T2W sekoje, mažėja.
NPE grupėje slankstelio kūno implantacijos vietoje galima pastebėti akivaizdžią kaulo hiperplaziją, o kaulų hiperplazija pasireiškia greičiau nuo 12 iki 20 savaičių (2C pav.), palyginti su NPE grupe, modeliuojamame stuburo slankstelyje reikšmingų pokyčių nepastebėta. kūnai; Apsimetinė grupė ir ME grupė (2C pav.) 2A,B).
(A) Implantuotos dalies slankstelio kūno paviršius yra labai lygus, skylė gerai gyja, o slankstelio kūne nėra hiperplazijos. (B) Implantuotos vietos forma ME grupėje yra panaši į fiktyvių operacijų grupę, ir laikui bėgant implantuotos vietos išvaizda akivaizdžių pokyčių nepasikeitė. (C) NPE grupėje implantuotoje vietoje įvyko kaulų hiperplazija. Kaulų hiperplazija sparčiai didėjo ir netgi tęsėsi per tarpslankstelinį diską iki priešingo slankstelio kūno.
Histologinė analizė suteikia išsamesnės informacijos apie kaulų formavimąsi. 3 paveiksle parodytos H&E dažytų pooperacinių skyrių nuotraukos. Apgaulingos operacijos grupėje chondrocitai buvo gerai išsidėstę ir nebuvo aptikta ląstelių proliferacijos (3A pav.). ME grupėje situacija buvo panaši kaip ir fiktyvios operacijos grupėje (3B pav.). Tačiau NPE grupėje implantacijos vietoje buvo pastebėtas didelis chondrocitų skaičius ir į NP panašių ląstelių dauginimasis (3C pav.);
(A) Trabekulės gali būti matomos šalia galinės plokštės, chondrocitai yra tvarkingai išdėstyti, vienodo dydžio ir formos ląstelės, be proliferacijos (40 kartų). (B) Implantacijos vietos būklė ME grupėje yra panaši į netikros grupės būklę. Galima matyti trabekulių ir chondrocitų, tačiau implantacijos vietoje akivaizdaus proliferacijos nėra (40 kartų). (B) Matyti, kad chondrocitai ir į NP panašios ląstelės žymiai daugėja, o chondrocitų forma ir dydis yra netolygi (40 kartų).
Interleukino 4 (IL-4) mRNR, interleukino 17 (IL-17) mRNR ir interferono γ (IFN-γ) mRNR ekspresija buvo stebima tiek NPE, tiek ME grupėse. Palyginus tikslinių genų ekspresijos lygius, IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų ekspresija buvo reikšmingai padidėjusi NPE grupėje, palyginti su ME ir fiktyvių operacijų grupėmis (4 pav.). (P < 0,05). Palyginti su fiktyvių operacijų grupe, IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresijos lygiai ME grupėje padidėjo tik nežymiai ir nepasiekė statistinio pokyčio (P > 0,05).
IL-4, IL-17 ir IFN-γ mRNR ekspresija NPE grupėje parodė žymiai didesnę tendenciją nei fiktyvių operacijų grupėje ir ME grupėje (P < 0,05).
Priešingai, raiškos lygiai ME grupėje reikšmingo skirtumo neparodė (P> 0, 05).
Western blot analizė buvo atlikta naudojant komerciškai prieinamus antikūnus prieš IL-4 ir IL-17, siekiant patvirtinti pakitusį mRNR ekspresijos modelį. Kaip parodyta 5A, B paveiksluose, palyginti su ME grupe ir fiktyvių operacijų grupe, IL-4 ir IL-17 baltymų kiekis NPE grupėje buvo reikšmingai padidėjęs (P < 0,05). Palyginti su fiktyvių operacijų grupe, IL-4 ir IL-17 baltymų kiekis ME grupėje taip pat nepasiekė statistiškai reikšmingų pokyčių (P> 0,05).
(A) IL-4 ir IL-17 baltymų kiekis NPE grupėje buvo žymiai didesnis nei ME grupėje ir placebo grupėje (P < 0,05). (B) Western blot histograma.
Dėl riboto operacijos metu gautų žmogaus mėginių skaičiaus aiškius ir išsamius MC patogenezės tyrimus sunku atlikti. Bandėme sukurti MC gyvūnų modelį, kad ištirtume galimus patologinius mechanizmus. Tuo pačiu metu radiologinis įvertinimas, histologinis įvertinimas ir molekulinis biologinis įvertinimas buvo naudojamas NP autografto sukelto MC eigai stebėti. Dėl to NP implantacijos modelis lėmė laipsnišką signalo intensyvumo pasikeitimą nuo 12 savaičių iki 20 savaičių (mišrus žemas signalas T1W sekose ir žemas signalas T2W sekose), rodantys audinių pokyčius ir histologinius bei molekulinius biologiniai vertinimai patvirtino radiologinio tyrimo rezultatus.
Šio eksperimento rezultatai rodo, kad NPE grupėje stuburo kūno pažeidimo vietoje atsirado regėjimo ir histologinių pokyčių. Tuo pačiu metu buvo stebima IL-4, IL-17 ir IFN-γ genų, taip pat IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija, o tai rodo, kad stuburo autologinio branduolio pulposus audinio pažeidimas. kūnas gali sukelti daugybę signalų ir morfologinių pokyčių. Nesunku pastebėti, kad gyvūno modelio stuburo kūnų signalo charakteristikos (žemas signalas T1W sekoje, mišrus signalas ir žemas signalas T2W sekoje) yra labai panašios į žmogaus stuburo ląstelių charakteristikas, o MRT charakteristikos taip pat. patvirtina histologijos ir stambiosios anatomijos stebėjimus, tai yra, stuburo kūno ląstelių pakitimai progresuoja. Nors ūminės traumos sukeltas uždegiminis atsakas gali pasireikšti netrukus po punkcijos, MRT rezultatai parodė, kad laipsniškai didėjantys signalo pokyčiai atsirado praėjus 12 savaičių po punkcijos ir išliko iki 20 savaičių be jokių atsigavimo ar MRT pokyčių požymių. Šie rezultatai rodo, kad autologinis stuburo NP yra patikimas būdas nustatyti progresuojančią MV triušiuose.
Šis punkcijos modelis reikalauja pakankamai įgūdžių, laiko ir chirurginių pastangų. Preliminarių eksperimentų metu dėl paravertebrinių raiščių struktūrų išpjaustymo arba per didelio stimuliavimo gali susidaryti stuburo osteofitai. Reikia stengtis nepažeisti ir nesudirginti gretimų diskų. Kadangi įsiskverbimo gylis turi būti kontroliuojamas, kad būtų gauti nuoseklūs ir atkuriami rezultatai, mes rankiniu būdu padarėme kamštį, nupjaudami 3 mm ilgio adatos apvalkalą. Naudojant šį kamštį užtikrinamas vienodas gręžimo gylis stuburo kūne. Atlikdami preliminarius eksperimentus, trys operacijoje dalyvavę ortopedai nustatė, kad su 16 dydžio adatomis lengviau dirbti nei su 18 dydžio adatomis ar kitais metodais. Kad išvengtumėte pernelyg didelio kraujavimo gręžimo metu, kurį laiką palaikydami adatą nejudėdami, susidarys tinkamesnė įvedimo anga, o tai rodo, kad tokiu būdu galima valdyti tam tikrą MC laipsnį.
Nors daugelis tyrimų buvo skirti MC, mažai žinoma apie MC25, 26, 27 etiologiją ir patogenezę. Remdamiesi ankstesniais tyrimais, mes nustatėme, kad autoimunitetas vaidina pagrindinį vaidmenį MC12 atsiradimui ir vystymuisi. Šiame tyrime buvo tiriama kiekybinė IL-4, IL-17 ir IFN-γ, kurie yra pagrindiniai CD4+ ląstelių diferenciacijos keliai po antigeno stimuliacijos, ekspresija. Mūsų tyrime, palyginti su neigiama grupe, NPE grupė turėjo didesnę IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresiją, o IL-4 ir IL-17 baltymų kiekis taip pat buvo didesnis.
Kliniškai IL-17 mRNR ekspresija padidėja NP ląstelėse pacientams, kuriems yra disko išvarža28. Padidėjęs IL-4 ir IFN-γ ekspresijos lygis taip pat buvo nustatytas ūminio nesuspaudimo disko išvaržos modelyje, palyginti su sveika kontrole29. IL-17 vaidina pagrindinį vaidmenį uždegimuose, audinių pažeidimuose sergant autoimuninėmis ligomis30 ir stiprina imuninį atsaką į IFN-γ31. Buvo pranešta apie padidėjusį IL-17 sukeltą audinių pažeidimą MRL/lpr pelėms32 ir autoimunitei jautrioms pelėms33. IL-4 gali slopinti priešuždegiminių citokinų (tokių kaip IL-1β ir TNFα) ekspresiją ir makrofagų aktyvaciją34. Buvo pranešta, kad IL-4 mRNR ekspresija NPE grupėje buvo kitokia, palyginti su IL-17 ir IFN-γ tuo pačiu metu; IFN-γ mRNR ekspresija NPE grupėje buvo žymiai didesnė nei kitose grupėse. Todėl IFN-γ gamyba gali būti NP interkalacijos sukelto uždegiminio atsako tarpininkas. Tyrimai parodė, kad IFN-γ gamina keli ląstelių tipai, įskaitant aktyvuotas 1 tipo pagalbines T ląsteles, natūralias žudikes ląsteles ir makrofagus35, 36, ir yra pagrindinis priešuždegiminis citokinas, skatinantis imuninį atsaką37.
Šis tyrimas rodo, kad autoimuninis atsakas gali būti susijęs su MC atsiradimu ir vystymusi. Luoma ir kt. nustatė, kad MC ir iškilaus NP signalo charakteristikos yra panašios atliekant MRT ir abu rodo aukštą signalą T2W sekoje38. Buvo patvirtinta, kad kai kurie citokinai yra glaudžiai susiję su MC atsiradimu, pavyzdžiui, IL-139. Ma ir kt. pasiūlė, kad NP išsikišimas aukštyn arba žemyn gali turėti didelės įtakos MC12 atsiradimui ir vystymuisi. Bobechko40 ir Herzbein ir kt.41 pranešė, kad NP yra imunotoleruojantis audinys, kuris nuo gimimo negali patekti į kraujagyslių kraujotaką. NP išsikišimai įveda svetimkūnius į kraujo tiekimą ir taip tarpininkauja vietinėms autoimuninėms reakcijoms42. Autoimuninės reakcijos gali sukelti daugybę imuninių veiksnių, o kai šie veiksniai yra nuolat veikiami audinių, jie gali sukelti signalizacijos pokyčius43. Šiame tyrime per didelė IL-4, IL-17 ir IFN-γ ekspresija yra tipiški imuniniai veiksniai, dar labiau įrodantys glaudų ryšį tarp NP ir MCs44. Šis gyvūno modelis gerai imituoja NP proveržį ir patekimą į galinę plokštę. Šis procesas dar labiau atskleidė autoimuniteto poveikį MC.
Kaip ir tikėtasi, šis gyvūnų modelis suteikia mums galimą platformą tirti MC. Tačiau šis modelis vis dar turi tam tikrų apribojimų: pirma, gyvūnų stebėjimo fazėje kai kuriuos vidutinės stadijos triušius reikia eutanazuoti, kad būtų atlikti histologiniai ir molekulinės biologijos tyrimai, todėl kai kurie gyvūnai laikui bėgant „nenaudojami“. Antra, nors šiame tyrime nustatyti trys laiko taškai, deja, sumodeliavome tik vieną MC tipą (Modic tipo I pokytis), todėl nepakanka reprezentuoti žmogaus ligos vystymosi procesą, reikia nustatyti daugiau laiko taškų geriau stebėti visus signalo pokyčius. Trečia, audinių struktūros pokyčius iš tiesų galima aiškiai parodyti histologiniu dažymu, tačiau kai kurie specializuoti metodai gali geriau atskleisti šio modelio mikrostruktūrinius pokyčius. Pavyzdžiui, poliarizuotos šviesos mikroskopija buvo naudojama fibrokremzlių susidarymui triušio tarpslanksteliniuose diskuose analizuoti45. Ilgalaikis NP poveikis MC ir galinei plokštelei reikalauja tolesnio tyrimo.
Penkiasdešimt keturi Naujosios Zelandijos baltųjų triušių patinai (svoris apie 2,5–3 kg, amžius 3–3,5 mėnesio) buvo atsitiktinai suskirstyti į fiktyvių operacijų grupę, raumenų implantavimo grupę (ME grupė) ir nervų šaknelių implantavimo grupę (NPE grupė). Visas eksperimentines procedūras patvirtino Tiandzino ligoninės etikos komitetas, o eksperimentiniai metodai buvo atlikti griežtai laikantis patvirtintų gairių.
S. Sobajimos chirurginė technika buvo patobulinta 46 . Kiekvienas triušis buvo paguldytas į šoną ir penkių iš eilės juosmens tarpslankstelinių diskų (IVD) priekinis paviršius buvo eksponuojamas naudojant posterolateralinį retroperitoninį metodą. Kiekvienam triušiui buvo suteikta bendra anestezija (20 % uretano, 5 ml/kg per ausies veną). Buvo padarytas išilginis odos pjūvis nuo apatinio šonkaulių krašto iki dubens krašto, 2 cm pilvo link paravertebralinių raumenų. Dešinysis priekinis šoninis stuburas nuo L1 iki L6 buvo apnuogintas aštriai ir bukais išpjaustant viršutinį poodinį audinį, retroperitoninį audinį ir raumenis (6A pav.). Disko lygis buvo nustatytas naudojant dubens kraštą kaip anatominį L5-L6 disko lygio orientyrą. Naudodami 16 dydžio pradūrimo adatą išgręžkite skylę šalia L5 slankstelio galinės plokštės iki 3 mm gylio (6B pav.). Naudokite 5 ml švirkštą, kad išsiurbtumėte autologinį pulpos branduolį L1-L2 tarpslanksteliniame diske (6C pav.). Pašalinkite pulpos branduolį arba raumenį pagal kiekvienos grupės reikalavimus. Įgilinus gręžimo angą, ant giliosios fascijos, paviršinės fascijos ir odos uždedami įsigeriantys siūlai, stengiantis, kad operacijos metu nepažeistumėte stuburo kūno periostealinio audinio.
(A) L5–L6 diskas eksponuojamas naudojant posterolateralinį retroperitoninį metodą. (B) Naudodami 16 dydžio adatą išgręžkite skylę šalia L5 galinės plokštės. (C) Surenkami autologiniai MF.
Bendroji anestezija buvo taikoma 20% uretano (5 ml/kg) tirpalu per ausies veną, o juosmeninės stuburo dalies rentgenogramos kartotos 12, 16 ir 20 savaičių po operacijos.
Triušiai buvo nužudyti į raumenis suleidus ketamino (25, 0 mg / kg) ir natrio pentobarbitalio (1, 2 g / kg) 12, 16 ir 20 savaičių po operacijos. Visas stuburas buvo pašalintas histologinei analizei ir atlikta reali analizė. Imuninių veiksnių pokyčiams nustatyti buvo naudojama kiekybinė atvirkštinė transkripcija (RT-qPCR) ir Western blotting.
MRT tyrimai buvo atlikti su triušiais, naudojant 3,0 T klinikinį magnetą (GE Medical Systems, Florencija, SC), turintį statmenos galūnės ritės imtuvą. Triušiai buvo anestezuoti 20% uretanu (5 ml/kg) per ausies veną, o po to gulėti ant magneto, juosmens sritis buvo nukreipta į 5 colių skersmens apskrito paviršiaus ritę (GE Medical Systems). Koronaliniai T2 svertiniai lokalizatoriaus vaizdai (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) buvo gauti, siekiant nustatyti juosmens disko vietą nuo L3–L4 iki L5–L6. Sagitalinės plokštumos T2 svertiniai pjūviai buvo gauti su šiais nustatymais: greita sukimosi aido seka, kurios pasikartojimo laikas (TR) yra 2200 ms, o aido laikas (TE) yra 70 ms, matrica; 260 ir aštuonių dirgiklių regėjimo laukas; Pjovimo storis 2 mm, tarpas 0,2 mm.
Po paskutinės nuotraukos padarymo ir paskutinio triušio nužudymo histologiniam tyrimui buvo pašalinti fiktyvūs, į raumenis įterpti ir NP diskai. Audiniai buvo fiksuoti 10% neutraliame buferiniame formaline 1 savaitę, nukalkinti etilendiaminotetraacto rūgštimi ir supjaustyti parafinu. Audinių blokai buvo įterpti į parafiną ir supjaustomi į sagitalines dalis (5 μm storio), naudojant mikrotomą. Pjūviai buvo nudažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E).
Surinkus tarpslankstelinius diskus iš kiekvienos grupės triušių, visa RNR buvo ekstrahuota naudojant UNIQ-10 kolonėlę (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Kinija) pagal gamintojo instrukcijas ir ImProm II atvirkštinės transkripcijos sistemą (Promega Inc. , Madison, WI, JAV). Buvo atlikta atvirkštinė transkripcija.
RT-qPCR buvo atlikta naudojant Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., JAV) ir SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. PGR reakcijos tūris buvo 20 μl ir jame buvo 1, 5 μl praskiestos cDNR ir 0, 2 μM kiekvieno pradmens. Gruntus sukūrė „OligoPerfect Designer“ („Invitrogen“, Valensija, CA), o pagamino „Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd.“ (Kinija) (1 lentelė). Buvo naudojamos šios terminio ciklo sąlygos: pradinė polimerazės aktyvinimo pakopa 94 °C temperatūroje 2 min., po to 40 ciklų po 15 s 94 °C temperatūroje šablono denatūravimui, 1 min. atkaitinimas 60 °C temperatūroje, pratęsimas ir fluorescencija. matavimai buvo atlikti 1 minutę 72°C temperatūroje. Visi mėginiai buvo amplifikuoti tris kartus, o vidutinė vertė buvo naudojama RT-qPCR analizei. Amplifikacijos duomenys buvo analizuojami naudojant FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, JAV). IL-4, IL-17 ir IFN-γ geno ekspresija buvo normalizuota iki endogeninės kontrolės (ACTB). Santykiniai tikslinės mRNR ekspresijos lygiai buvo apskaičiuoti naudojant 2-ΔΔCT metodą.
Visas baltymas buvo ekstrahuotas iš audinių, naudojant audinių homogenizatorių RIPA lizės buferyje (sudėtyje yra proteazės ir fosfatazės inhibitorių kokteilis), o po to centrifuguojamas 13 000 aps./min 20 minučių 4 ° C temperatūroje, kad pašalintų audinių liekanas. Į vieną juostą buvo įdėta 50 mikrogramų baltymų, atskirta 10% SDS-PAGE, o po to perkelta į PVDF membraną. Blokavimas buvo atliktas 5% neriebiame sausame piene Tris buferiniame fiziologiniame tirpale (TBS), kuriame yra 0, 1% Tween 20, 1 valandą kambario temperatūroje. Membrana buvo inkubuojama su triušio anti-decorin pirminiu antikūnu (atskiestas 1:200; Boster, Uhanas, Kinija) (atskiestas 1:200; Bioss, Pekinas, Kinija) per naktį 4 °C temperatūroje ir reagavo antromis dienomis; su antriniu antikūnu (ožkos anti-triušio imunoglobulinas G, praskiedus 1:40 000) kartu su krienų peroksidaze (Boster, Uhanas, Kinija) 1 valandą kambario temperatūroje. Western blot signalai buvo aptikti padidinus chemiliuminescencinę membraną po rentgeno spinduliuotės. Densitometrinei analizei blotai buvo nuskaityti ir kiekybiškai įvertinti naudojant BandScan programinę įrangą, o rezultatai buvo išreikšti kaip tikslinio geno imunoreaktyvumo ir tubulino imunoreaktyvumo santykis.
Statistiniai skaičiavimai atlikti naudojant SPSS16.0 programinį paketą (SPSS, JAV). Tyrimo metu surinkti duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (vidurkis ± SD) ir analizuojami naudojant vienpusę kartotinių matavimų dispersijos analizę (ANOVA), siekiant nustatyti skirtumus tarp dviejų grupių. P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.
Taigi gyvūninio MC modelio sukūrimas implantuojant autologinius NP į stuburo kūną ir atliekant makroanatominį stebėjimą, MRT analizę, histologinį įvertinimą ir molekulinę biologinę analizę gali tapti svarbia priemone žmogaus MC mechanizmams įvertinti ir suprasti bei kurti naujus terapinius metodus. intervencijos.
Kaip cituoti šį straipsnį: Han, C. ir kt. Modic pokyčių gyvūnų modelis buvo sukurtas implantuojant autologinį pulpos branduolį į juosmeninės stuburo dalies subchondrinį kaulą. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. ir Boos, N. Juosmens stuburo magnetinio rezonanso tomografija: disko išvaržos ir susilaikymo paplitimas, nervų šaknelių suspaudimas, galinės plokštelės anomalijos ir briaunų sąnarių osteoartritas besimptomiams savanoriams . norma. Radiology 209, 661–666, doi: 10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS ir Leboeuf-Eed, K. Modic pokyčiai ir jų ryšys su klinikiniais duomenimis. European Spine Journal: oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijų draugijos ir Europos gimdos kaklelio stuburo tyrimų draugijos leidinys 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. ir kt. Modiciniai juosmens slankstelių galinių plokštelių pokyčiai: paplitimas ir ryšys su juosmens skausmu ir išialgiu vidutinio amžiaus darbuotojams. Spine 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. ir Dalinka, M. Kaulų čiulpų pakitimų netoli galinės plokštelės MRT sergant degeneracine juosmens stuburo liga. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ ir Carter, JR. Degeneracinė disko liga: stuburo čiulpų pokyčių įvertinimas naudojant MRT. Radiology 166, 193–199, doi: 10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS ir Carter, JR. Degeneracinės disko ligos vaizdavimas. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS ir kt. Neovertebral galinės plokštelės (Modic) prognozuotojai signalizuoja bendrosios populiacijos pokyčius. European Spine Journal: oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijų draugijos ir Europos gimdos kaklelio stuburo tyrimų draugijos leidinys, 19 skyrius, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB ir Mannisch, K. Modic pokyčiai po juosmens disko išvaržos. Europos stuburo leidinys: oficialus Europos stuburo draugijos, Europos stuburo deformacijų draugijos ir Europos gimdos kaklelio stuburo tyrimų draugijos leidinys 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. Modic tipo I pokyčiai gali numatyti sparčiai progresuojančią deformacinę disko degeneraciją: 1 metų perspektyvinis tyrimas. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ ir Fan, SW Modiciniai pokyčiai: galimos juosmens disko degeneracijos priežastys ir indėlis. Medicinos hipotezės 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Vidinio disko plyšimas. Disko prolapso problemos per 50 metų. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Paskelbimo laikas: 2024-12-13