Žmogaus skeleto raumenų skaidulų heterogeniškumas už miozino sunkiosios grandinės ribų

Dėkojame, kad apsilankėte nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad patirtis būtų geriausia, rekomenduojame naudoti naujausią naršyklės versiją (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Be to, siekiant užtikrinti nuolatinį palaikymą, šioje svetainėje nebus stilių ir „JavaScript“.
Skeleto raumenys yra heterogeninis audinys, daugiausia sudarytas iš miofibrilių, kurios žmonėms paprastai skirstomos į tris tipus: vieną „lėtąjį“ (1 tipas) ir du „greituosius“ (2A ir 2X tipai). Tačiau heterogeniškumas tarp tradicinių miofibrilių tipų ir jų viduje vis dar menkai suprantamas. Transkriptominį ir proteominį metodus taikėme atitinkamai 1050 ir 1038 atskiroms žmogaus plačiojo šoninio raumens (vastus lateralis) miofibrilėms. Proteominiame tyrime dalyvavo vyrai, o transkriptominiame tyrime – 10 vyrų ir 2 moterys. Be miozino sunkiosios grandinės izoformų, kaip daugiamačio tarpmiofibrilių kintamumo šaltinius nustatėme metabolinius baltymus, ribosominius baltymus ir ląstelių jungčių baltymus. Be to, nepaisant lėtų ir greitų skaidulų grupių nustatymo, mūsų duomenys rodo, kad 2X tipo skaidulos fenotipiškai nesiskiria nuo kitų greito susitraukimo skaidulų. Be to, miozino sunkiosios grandinės pagrindu sudaryta klasifikacija nėra pakankama, kad būtų galima apibūdinti miofibrilių fenotipą nemalino miopatijose. Apskritai, mūsų duomenys rodo daugiamatį miofibro heterogeniškumą, o variacijos šaltiniai apima ne tik miozino sunkiosios grandinės izoformas.
Ląstelių heterogeniškumas yra būdingas visų biologinių sistemų bruožas, leidžiantis ląstelėms specializuotis, kad patenkintų skirtingus audinių ir ląstelių poreikius.1 Tradicinis požiūris į griaučių raumenų skaidulų heterogeniškumą buvo tas, kad motoriniai neuronai apibrėžia skaidulų tipą motoriniame vienete, o skaidulų tipą (t. y. 1, 2A ir 2X tipus žmonėms) lemia miozino sunkiosios grandinės (MYH) izoformų savybės.2 Iš pradžių tai buvo pagrįsta jų pH ATPazės nestabilumu,3,4 o vėliau – MYH molekuline raiška.5 Tačiau identifikavus ir vėliau priėmus „mišrias“ skaidulas, kurios kartu ekspresuoja kelis MYH įvairiomis proporcijomis, griaučių raumenų skaidulos vis dažniau laikomos tęstiniu, o ne atskirais skaidulų tipais.6 Nepaisant to, ši sritis vis dar labai remiasi MYH kaip pagrindiniu miofibrilų klasifikavimo klasifikatoriumi – šiam požiūriui greičiausiai įtakos turėjo ankstyvųjų graužikų tyrimų, kurių MYH raiškos profiliai ir skaidulų tipų diapazonas skiriasi nuo žmonių, apribojimai ir reikšmingi šališkumai.2 Padėtį dar labiau apsunkina tai, kad skirtingi žmogaus griaučių raumenys pasižymi įvairiais skaidulų tipais.7 Lateralinis šoninis plačiajuostis raumenys yra mišrus raumuo su tarpiniu (taigi reprezentatyviu) MYH raiškos profiliu.7 Be to, dėl lengvo mėginių ėmimo tai yra geriausiai ištirtas žmogaus raumuo.
Taigi, nešališkas griaučių raumenų skaidulų įvairovės tyrimas naudojant galingus „omikos“ įrankius yra labai svarbus, bet kartu ir sudėtingas, iš dalies dėl griaučių raumenų skaidulų daugiabranduoliškumo. Tačiau pastaraisiais metais transkriptikos8,9 ir proteomikos10 technologijų jautrumas smarkiai pasikeitė dėl įvairių technologinių pasiekimų, leidžiančių analizuoti griaučių raumenis vieno pluošto skiriamąja geba. Dėl to padaryta didelė pažanga apibūdinant vieno pluošto įvairovę ir jų reakciją į atrofinius dirgiklius ir senėjimą11,12,13,14,15,16,17,18. Svarbu tai, kad šie technologiniai pasiekimai turi klinikinį pritaikymą, leidžiantį išsamiau ir tiksliau apibūdinti su liga susijusią disreguliaciją. Pavyzdžiui, nemalino miopatijos, vienos iš labiausiai paplitusių paveldimų raumenų ligų (MIM 605355 ir MIM 161800), patofiziologija yra sudėtinga ir paini.19,20 Todėl geresnis griaučių raumenų skaidulų disreguliacijos apibūdinimas galėtų lemti reikšmingą šios ligos supratimo pažangą.
Sukūrėme transkriptominės ir proteominės analizės metodus, skirtus pavienėms griaučių raumenų skaiduloms, rankiniu būdu išskirtoms iš žmogaus biopsijos mėginių, analizuoti, ir pritaikėme juos tūkstančiams skaidulų, taip tirdami žmogaus griaučių raumenų skaidulų ląstelinį heterogeniškumą. Šio darbo metu pademonstravome transkriptominio ir proteominio raumenų skaidulų fenotipavimo galią ir nustatėme metabolinius, ribosominius ir ląstelinius jungčių baltymus kaip reikšmingus tarpskaidulinių skaidulų kintamumo šaltinius. Be to, naudodami šį proteomikos darbo eigą, apibūdinome nematodų miopatijos klinikinę reikšmę pavienėse griaučių raumenų skaidulose, atskleisdami koordinuotą poslinkį link neoksidatyvių skaidulų, nepriklausomai nuo skaidulų tipo, remiantis MYH.
Siekdami ištirti žmogaus griaučių raumenų skaidulų heterogeniškumą, sukūrėme du darbo eigą, leidžiančią atlikti atskirų griaučių raumenų skaidulų transkriptomų ir proteomų analizę (1A pav. ir papildomas 1A pav.). Sukūrėme ir optimizavome kelis metodologinius žingsnius – nuo ​​mėginių saugojimo ir RNR bei baltymų vientisumo išsaugojimo iki kiekvieno metodo pralaidumo optimizavimo. Transkriptomų analizei tai buvo pasiekta įterpiant mėginiui būdingus molekulinius brūkšninius kodus pradiniame atvirkštinės transkripcijos etape, leidžiant sujungti 96 skaidulas efektyviam tolesniam apdorojimui. Gilesnė sekvenavimas (±1 milijonas nuskaitymų vienai skaidulai), palyginti su tradiciniais vienos ląstelės metodais, dar labiau praturtino transkriptomų duomenis.21 Proteomikai naudojome trumpą chromatografinį gradientą (21 minutę) kartu su DIA-PASEF duomenų rinkimu timsTOF masių spektrometru, siekdami optimizuoti proteomų gylį, išlaikydami didelį pralaidumą.22,23 Norėdami ištirti sveikų griaučių raumenų skaidulų heterogeniškumą, apibūdinome 1050 atskirų skaidulų iš 14 sveikų suaugusių donorų transkriptomas ir 1038 skaidulų iš 5 sveikų suaugusių donorų proteomas (1 papildoma lentelė). Šiame straipsnyje šie duomenų rinkiniai atitinkamai vadinami 1000 skaidulų transkriptomomis ir proteomomis. Mūsų metodas 1000 skaidulų transkriptominėje ir proteominėje analizėse aptiko iš viso 27 237 transkriptus ir 2983 baltymus (1A pav., papildomi duomenų rinkiniai 1–2). Atfiltravus transkriptominius ir proteominius duomenų rinkinius, kad būtų aptikta >1000 genų ir 50 % galiojančių verčių kiekvienam skaidulos vienetui, buvo atlikta tolesnė bioinformatinė analizė atitinkamai 925 ir 974 skaiduloms transkriptome ir proteome. Po filtravimo kiekviename skaidulos vienete aptikta vidutiniškai 4257 ± 1557 genai ir 2015 ± 234 baltymai (vidurkis ± SD), o tarpasmeninis kintamumas buvo ribotas (papildomi 1B–C paveikslai, papildomi duomenų rinkiniai 3–4). Tačiau kintamumas to paties tiriamojo tarpe buvo ryškesnis, greičiausiai dėl skirtingo RNR/baltymų išeigos tarp skirtingo ilgio ir skerspjūvio ploto skaidulų. Daugumai baltymų (>2000) variacijos koeficientas buvo mažesnis nei 20 % (papildomas 1D paveikslas). Abu metodai leido užfiksuoti platų transkriptų ir baltymų, turinčių labai išreikštus raumenų susitraukimui svarbius parašus (pvz., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3), dinaminį diapazoną (papildomi 1E–F paveikslai). Dauguma nustatytų požymių buvo bendri transkriptominiuose ir proteominiuose duomenų rinkiniuose (papildomas 1G paveikslas), o šių požymių vidutiniai UMI/LFQ intensyvumai buvo gana gerai koreliuojami (r = 0,52) (papildomas 1H paveikslas).
Transkriptomikos ir proteomikos darbo eiga (sukurta naudojant „BioRender.com“). BD MYH7, MYH2 ir MYH1 dinaminio diapazono kreivės ir apskaičiuotos skaidulų tipo priskyrimo ribos. E, F MYH raiškos pasiskirstymas tarp skaidulų transkriptomikos ir proteomikos duomenų rinkiniuose. G, H Vienodos įvairovės aproksimacijos ir projekcijos (UMAP) grafikai transkriptomikai ir proteomikai, nuspalvinti pagal MYH pagrindu sukurtą skaidulų tipą. I, J Savybių grafikai, rodantys MYH7, MYH2 ir MYH1 raišką transkriptomikos ir proteomikos duomenų rinkiniuose.
Iš pradžių siekėme priskirti MYH pagrindu sukurtą skaidulų tipą kiekvienam skaidulų tipui, naudodami optimizuotą metodą, kuris išnaudoja didelį MYH raiškos jautrumą ir dinaminį diapazoną omikos duomenų rinkiniuose. Ankstesniuose tyrimuose buvo naudojamos savavališkos ribos, siekiant skaidulas žymėti kaip gryną 1 tipo, 2A tipo, 2X tipo arba mišrias, remiantis fiksuotu skirtingų MYH raiškos procentu11,14,24. Mes taikėme kitokį metodą, kai kiekvienos skaidulos raiška buvo reitinguojama pagal MYH, kuriuos naudojome skaidulų tipizavimui: MYH7, MYH2 ir MYH1, atitinkančius atitinkamai 1 tipo, 2A tipo ir 2X tipo skaidulas. Tada matematiškai apskaičiavome kiekvienos gautos kreivės apatinį vingio tašką ir panaudojome jį kaip ribą, kad kiekvienam MYH priskirtume skaidulas teigiamoms (virš slenksčio) arba neigiamoms (žemiau slenksčio) (1B–D pav.). Šie duomenys rodo, kad MYH7 (1B pav.) ir MYH2 (1C pav.) turi ryškesnius įjungimo/išjungimo raiškos profilius RNR lygmenyje, palyginti su baltymų lygmenimis. Iš tiesų, baltymų lygmenyje labai mažai skaidulų neekspresavo MYH7, ir nė viena skaidula neturėjo 100 % MYH2 ekspresijos. Toliau naudojome iš anksto nustatytas ekspresijos ribas, kad priskirtume MYH pagrindu sukurtų skaidulų tipus visoms skaiduloms kiekviename duomenų rinkinyje. Pavyzdžiui, MYH7+/MYH2-/MYH1- skaidulos buvo priskirtos 1 tipui, o MYH7-/MYH2+/MYH1+ skaidulos – mišriam 2A/2X tipui (išsamų aprašymą žr. 2 papildomoje lentelėje). Sujungę visas skaidulas, pastebėjome stebėtinai panašų MYH pagrindu sukurtų skaidulų tipų pasiskirstymą tiek RNR (1E pav.), tiek baltymų (1F pav.) lygmenimis, o santykinė MYH pagrindu sukurtų skaidulų tipų sudėtis, kaip ir tikėtasi, skyrėsi tarp individų (2A papildomas pav.). Dauguma skaidulų buvo klasifikuojamos kaip grynas 1 tipas (34–35 %) arba 2A tipas (36–38 %), nors taip pat buvo aptiktas nemažas skaičius mišraus 2A/2X tipo skaidulų (16–19 %). Ryškus skirtumas yra tas, kad grynus 2X tipo pluoštus galima aptikti tik RNR, bet ne baltymų lygmenyje, o tai rodo, kad greita MYH raiška yra bent iš dalies reguliuojama po transkripcijos.
Savo proteomika pagrįstą MYH skaidulų tipizavimo metodą patvirtinome naudodami antikūnais pagrįstą taškinį blotingą, ir abu metodai pasiekė 100 % atitikimą identifikuojant grynus 1 tipo ir 2A tipo skaidulas (žr. papildomą 2B paveikslą). Tačiau proteomika pagrįstas metodas buvo jautresnis, efektyvesnis identifikuojant mišrias skaidulas ir kiekybiškai nustatant kiekvieno MYH geno dalį kiekvienoje skaiduloje. Šie duomenys rodo objektyvaus, labai jautraus omika pagrįsto metodo efektyvumą apibūdinti griaučių raumenų skaidulų tipus.
Tuomet panaudojome transkriptomikos ir proteomikos pateiktą bendrą informaciją, kad objektyviai klasifikuotume miofibrilus pagal jų pilną transkriptomą arba proteomą. Naudodami vienodo daugialypės įvairovės aproksimacijos ir projekcijos (UMAP) metodą, kad sumažintume matmenis iki šešių pagrindinių komponentų (papildomi 3A–B paveikslai), galėjome vizualizuoti miofibrilių kintamumą transkriptome (1G paveikslas) ir proteome (1H paveikslas). Pažymėtina, kad miofibrilės nebuvo grupuojamos pagal dalyvius (papildomi 3C–D paveikslai) ar tyrimo dienas (papildomas 3E paveikslas) nei transkriptomikos, nei proteomikos duomenų rinkiniuose, o tai rodo, kad skeleto raumenų skaidulų kintamumas vieno tiriamojo viduje yra didesnis nei kintamumas tarp tiriamųjų. UMAP diagramoje išryškėjo du skirtingi klasteriai, vaizduojantys „greitus“ ir „lėtus“ miofibrilus (1G–H paveikslai). MYH7+ (lėtosios) mioskaidulos buvo susitelkusios ties teigiamu UMAP1 poliumi, o MYH2+ ir MYH1+ (greitosios) mioskaidulos – ties neigiamu UMAP1 poliumi (1I–J pav.). Tačiau pagal MYH raišką nebuvo atskirti greito susitraukimo skaidulų tipai (t. y. 2A tipas, 2X tipas arba mišrus 2A/2X), o tai rodo, kad MYH1 (1I–J pav.) ar kitų klasikinių 2X mioskaidulų žymenų, tokių kaip ACTN3 arba MYLK2 (papildomi 4A–B pav.), raiška neatskiria skirtingų mioskaidulų tipų, vertinant visą transkriptomą ar proteomą. Be to, palyginti su MYH2 ir MYH7, nedaug transkriptų ar baltymų teigiamai koreliavo su MYH1 (papildomi 4C–H pav.), o tai rodo, kad MYH1 gausa nevisiškai atspindi mioskaidulų transkriptomą/proteomą. Panašios išvados buvo padarytos vertinant trijų MYH izoformų mišrią raišką UMAP lygmenyje (papildomi 4I–J pav.). Taigi, nors 2X skaidulas galima identifikuoti transkripto lygmenyje remiantis vien MYH kiekybiniu įvertinimu, MYH1+ skaidulų negalima atskirti nuo kitų greitųjų skaidulų, vertinant visą transkriptomą ar proteomą.
Pradėdami lėtųjų skaidulų heterogeniškumo tyrimą, neapsiribodami MYH, įvertinome keturis nusistovėjusius lėtųjų skaidulų tipui būdingus baltymus: TPM3, TNNT1, MYL3 ir ATP2A22. Lėtųjų skaidulų potipiai parodė aukštą, nors ir ne tobulą, Pearsono koreliaciją su MYH7 tiek transkriptomikoje (papildomas 5A paveikslas), tiek proteomikoje (papildomas 5B paveikslas). Maždaug 25 % ir 33 % lėtųjų skaidulų nebuvo klasifikuojamos kaip grynos lėtosios skaidulos pagal visus genų/baltymų potipius transkriptomikoje (papildomas 5C paveikslas) ir proteomikoje (papildomas 5D paveikslas). Todėl lėtųjų skaidulų klasifikacija, pagrįsta keliais genų/baltymų potipiais, sukelia papildomo sudėtingumo net ir baltymams, kurie, kaip žinoma, yra specifiniai skaidulų tipui. Tai rodo, kad skaidulų klasifikacija, pagrįsta vieno geno/baltymų šeimos izoformomis, gali nepakankamai atspindėti tikrąjį griaučių raumenų skaidulų heterogeniškumą.
Siekdami toliau tirti žmogaus griaučių raumenų skaidulų fenotipinį kintamumą viso omikos modelio mastu, atlikome nešališką duomenų dimensijų mažinimą, naudodami pagrindinių komponentų analizę (PCA) (2A pav.). Panašiai kaip UMAP grafikuose, nei dalyvis, nei testavimo diena neturėjo įtakos skaidulų klasterizacijai PCA lygmeniu (papildomi 6A–C paveikslai). Abiejuose duomenų rinkiniuose MYH pagrindu veikiantį skaidulų tipą paaiškino PC2, kuris parodė lėto susitraukimo 1 tipo skaidulų klasterį ir antrąjį klasterį, kuriame buvo greito susitraukimo 2A ​​tipo, 2X tipo ir mišrios 2A/2X skaidulos (2A pav.). Abiejuose duomenų rinkiniuose šiuos du klasterius jungė nedidelis skaičius mišraus 1/2A tipo skaidulų. Kaip ir tikėtasi, pagrindinių PC vairuotojų perteklinio reprezentavimo analizė patvirtino, kad PC2 buvo valdomas susitraukimo ir metabolinių parašų (2B pav. ir papildomi 6D–E paveikslai, papildomi 5–6 duomenų rinkiniai). Apskritai nustatyta, kad MYH pagrindu sukurto pluošto tipas paaiškina nuolatinę PC2 variaciją, išskyrus vadinamuosius 2X pluoštus, kurie buvo paskirstyti visoje transkriptomoje greitajame klasteryje.
A. Transkriptomo ir proteomo duomenų rinkinių pagrindinių komponentų analizės (PCA) grafikai, nuspalvinti pagal skaidulų tipą, pagrįstą MYH. B. Transkripto ir baltymų variklių praturtinimo analizė PC2 ir PC1. Statistinė analizė atlikta naudojant „clusterProfiler“ paketą ir Benjamini-Hochbergo pakoreguotas p reikšmes. C, D. PCA grafikai, nuspalvinti pagal tarpląstelinio adhezijos genų ontologijos (GO) terminus transkriptome ir kostameros GO terminus proteome. Rodyklės rodo transkripto ir baltymo variklius bei jų kryptis. E, F. Kliniškai reikšmingų požymių vienodo daugialypio aproksimacijos ir projekcijos (UMAP) grafikai, rodantys raiškos gradientus, nepriklausomus nuo lėto/greito skaidulų tipo. G, H. Koreliacijos tarp PC2 ir PC1 variklių transkriptomose ir proteomose.
Netikėtai MYH pagrindu sukurtas miofibrilių tipas paaiškino tik antrą pagal dydį kintamumo laipsnį (PC2), o tai rodo, kad kiti biologiniai veiksniai, nesusiję su MYH pagrindu sukurtu miofibrilių tipu (PC1), vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant griaučių raumenų skaidulų heterogeniškumą. Pagrindinių PC1 veiksnių perteklinio reprezentavimo analizė parodė, kad PC1 kintamumą daugiausia lėmė ląstelių adhezija ir ribosomų kiekis transkriptome, o kostameros ir ribosominiai baltymai proteome (2B pav. ir papildomi 6D–E pav., papildomas duomenų rinkinys 7). Skeleto raumenyse kostameros jungia Z diską su sarkolemma ir dalyvauja jėgos perdavime bei signalizacijoje. 25 Anotuoti PCA grafikai, naudojant ląstelių adhezijos (transkriptomas, 2C pav.) ir kostamerų (proteomas, 2D pav.) ypatybes, atskleidė stiprų PC1 poslinkį į kairę, rodantį, kad šie požymiai yra praturtinti tam tikrose skaidulose.
Išsamesnis miofibrilų klasterizacijos UMAP lygmenyje tyrimas parodė, kad dauguma požymių pasižymėjo nuo miofibrilų tipo nepriklausomu MYH pagrindu sukurtu raiškos gradientu, o ne miofibrilų subklasteriui būdingu raiškos gradientu. Šis tęstinumas pastebėtas keliems su patologinėmis būklėmis susijusiems genams (2E pav.), tokiems kaip CHCHD10 (neuromuskulinė liga), SLIT3 (raumenų atrofija), CTDNEP1 (raumenų liga). Šis tęstinumas taip pat pastebėtas visame proteome, įskaitant baltymus, susijusius su neurologiniais sutrikimais (UGDH), insulino signalizacija (PHIP) ir transkripcija (HIST1H2AB) (2F pav.). Apibendrinus šiuos duomenis, galima teigti, kad skirtingose ​​miofibrilose yra nuo skaidulų tipo nepriklausomas lėto/greito susitraukimo heterogeniškumas.
Įdomu tai, kad PC2 vairuotojo genai parodė gerą transkriptomo ir proteomo koreliaciją (r = 0,663) (2G pav.), o tai rodo, kad lėto ir greito susitraukimo skaidulų tipai, o ypač griaučių raumenų skaidulų susitraukimo ir metabolinės savybės, yra transkripcijos reguliuojami. Tačiau PC1 vairuotojo genai neparodė jokios transkriptomo ir proteomo koreliacijos (r = -0,027) (2H pav.), o tai rodo, kad su lėto/greito susitraukimo skaidulų tipais nesusiję variantai daugiausia reguliuojami po transkripcijos. Kadangi PC1 variantai pirmiausia buvo paaiškinti ribosominių genų ontologijos terminais ir atsižvelgiant į tai, kad ribosomos atlieka labai svarbų ir specializuotą vaidmenį ląstelėje, aktyviai dalyvaudamos baltymų transliacijoje ir jai darydamos įtaką,31 toliau ėmėmės tirti šį netikėtą ribosominį heterogeniškumą.
Pirmiausia nuspalvinome proteomikos pagrindinių komponentų analizės grafiką pagal santykinį baltymų gausumą GOCC termine „citoplazminė ribosoma“ (3A pav.). Nors šis terminas yra praturtintas teigiamoje PC1 pusėje, todėl gradientas yra mažas, ribosominiai baltymai skatina skaidymąsi abiem PC1 kryptimis (3A pav.). Ribosominiai baltymai, praturtinti neigiamoje PC1 pusėje, apėmė RPL18, RPS18 ir RPS13 (3B pav.), o RPL31, RPL35 ir RPL38 (3C pav.) buvo pagrindiniai veiksniai teigiamoje PC1 pusėje. Įdomu tai, kad RPL38 ir RPS13 buvo labai ekspresuojami skeleto raumenyse, palyginti su kitais audiniais (papildomas 7A pav.). Šių išskirtinių ribosominių PC1 parašų transkriptome nepastebėta (papildomas 7B pav.), o tai rodo potranskripcinę reguliaciją.
A. Pagrindinių komponentų analizės (PCA) grafikas, nuspalvintas pagal citoplazminės ribosominės genų ontologijos (GO) terminus visoje proteomoje. Rodyklės rodo baltymų sukeltos variacijos kryptį PCA grafike. Linijos ilgis atitinka pagrindinio komponento balą tam tikram baltymui. B, C. PCA požymių grafikai RPS13 ir RPL38. D. Neprižiūrima citoplazminių ribosominių baltymų hierarchinė klasterizacinė analizė. E. 80S ribosomos struktūrinis modelis (PDB: 4V6X), kuriame išryškinami ribosominiai baltymai su skirtingu kiekiu skeleto raumenų skaidulose. F. Ribosominiai baltymai su skirtinga stechiometrija, lokalizuoti netoli mRNR išėjimo kanalo.
Anksčiau buvo pasiūlytos ribosominio heterogeniškumo ir specializacijos koncepcijos, pagal kurias skirtingų ribosomų subpopuliacijų buvimas (ribosominis heterogeniškumas) gali tiesiogiai paveikti baltymų transliaciją skirtinguose audiniuose32 ir ląstelėse33 per selektyvią specifinių mRNR transkriptų telkinių34 transliaciją (ribosomų specializacija). Norėdami nustatyti ribosominių baltymų, koekspresuojamų griaučių raumenų skaidulose, subpopuliacijas, atlikome neprižiūrimą hierarchinę ribosominių baltymų klasterizavimo analizę proteome (3D pav., 8 papildomas duomenų rinkinys). Kaip ir tikėtasi, ribosominiai baltymai nesigrupavo pagal skaidulų tipą, pagrįstą MYH. Tačiau nustatėme tris skirtingus ribosominių baltymų klasterius; pirmasis klasteris (ribosominis_klasteris_1) yra koreguliuojamas su RPL38, todėl jo raiška padidėja skaidulose su teigiamu PC1 profiliu. Antrasis klasteris (ribosominis_klasteris_2) yra koreguliuojamas su RPS13 ir jo raiška padidėja skaidulose su neigiamu PC1 profiliu. Trečiasis klasteris (ribosominis_klasteris_3) nerodo koordinuotos diferencinės raiškos griaučių raumenų skaidulose ir gali būti laikomas „pagrindiniu“ griaučių raumenų ribosominiu baltymu. Abiejuose ribosomų klasteriuose – 1 ir 2 – yra ribosominių baltymų, kurie, kaip anksčiau buvo įrodyta, reguliuoja alternatyvųjį transliavimą (pvz., RPL10A, RPL38, RPS19 ir RPS25) ir funkciškai veikia vystymąsi (pvz., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Sutampa su PCA rezultatais, pastebėtas heterogeniškas šių ribosominių baltymų vaizdavimas skaidulose taip pat parodė tęstinumą (papildomas 7C paveikslas).
Norėdami vizualizuoti heterogeninių ribosominių baltymų vietą ribosomoje, panaudojome žmogaus 80S ribosomos struktūrinį modelį („Protein Data Bank“: 4V6X) (3E pav.). Izoliavus ribosominius baltymus, priklausančius skirtingiems ribosomų klasteriams, jų vietos nebuvo glaudžiai sutapusios, o tai rodo, kad mūsų metodas neužtikrino tam tikrų ribosomos regionų/frakcijų praturtinimo. Įdomu tai, kad didelių subvienetų baltymų dalis 2 klasteryje buvo mažesnė nei 1 ir 3 klasteriuose (papildomas 7D pav.). Pastebėjome, kad baltymai su pakitusia stechiometrija skeleto raumenų skaidulose daugiausia buvo lokalizuoti ribosomos paviršiuje (3E pav.), o tai atitinka jų gebėjimą sąveikauti su vidinės ribosomos įėjimo vietos (IRES) elementais skirtingose ​​mRNR populiacijose, taip koordinuojant selektyvią transliaciją.40, 41 Be to, daugelis baltymų su pakitusia stechiometrija skeleto raumenų skaidulose buvo šalia funkcinių sričių, tokių kaip mRNR išėjimo tunelis (3F pav.), kurios selektyviai reguliuoja specifinių peptidų transliacijos pailgėjimą ir sustojimą. 42 Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad griaučių raumenų ribosominių baltymų stechiometrija pasižymi heterogeniškumu, dėl kurio atsiranda skirtumų tarp griaučių raumenų skaidulų.
Toliau siekėme nustatyti greito ir lėto susitraukimo skaidulų parašus ir ištirti jų transkripcijos reguliavimo mechanizmus. Palyginus greito ir lėto susitraukimo skaidulų grupes, apibrėžtas UMAP dviejuose duomenų rinkiniuose (1G–H ir 4A–B paveikslai), transkriptominė ir proteominė analizės nustatė atitinkamai 1366 ir 804 skirtingai gausius požymius (4A–B paveikslai, papildomi duomenų rinkiniai 9–12). Stebėjome laukiamus parašų skirtumus, susijusius su sarkomeromis (pvz., tropomiozinu ir troponinu), sužadinimo-susitraukimo sąsaja (SERCA izoformos) ir energijos metabolizmu (pvz., ALDOA ir CKB). Be to, transkriptai ir baltymai, reguliuojantys baltymų ubikvitinaciją, buvo skirtingai ekspresuojami greito ir lėto susitraukimo skaidulose (pvz., USP54, SH3RF2, USP28 ir USP48) (4A–B paveikslai). Be to, mikrobinio baltymo genas RP11-451G4.2 (DWORF), kuris anksčiau buvo įrodytas skirtingai ekspresuojamas skirtinguose ėriuko raumenų skaidulų tipuose43 ir sustiprina SERCA aktyvumą širdies raumenyje44, buvo reikšmingai padidintas lėtose griaučių raumenų skaidulose (4A pav.). Panašiai, atskirų skaidulų lygmenyje pastebėti reikšmingi skirtumai žinomuose parašuose, tokiuose kaip su metabolizmu susijusios laktatdehidrogenazės izoformos (LDHA ir LDHB, 4C pav. ir papildomas 8A pav.)45,46, taip pat anksčiau nežinomuose skaidulų tipui būdinguose parašuose (pvz., IRX3, USP54, USP28 ir DPYSL3) (4C pav.). Pastebėtas reikšmingas skirtingai ekspresuojamų požymių sutapimas tarp transkriptominių ir proteominių duomenų rinkinių (papildomas 8B pav.), taip pat kartų pokyčio koreliacija, kurią daugiausia lėmė ryškesnė skirtinga sarkomerų požymių raiška (papildomas 8C pav.). Pažymėtina, kad kai kurie parašai (pvz., USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) parodė stiprų posttranskripcijos reguliavimą tik proteominiu lygmeniu ir turėjo lėto / greito trūkčiojimo skaidulų tipui būdingus ekspresijos profilius (papildomas 8C paveikslas).
A ir B ugnikalnių grafikai, kuriuose lyginami lėti ir greiti klasteriai, identifikuoti pagal vienodos daugialypės aproksimacijos ir projekcijos (UMAP) grafikus, pavaizduotus 1G–H paveiksluose. Spalvoti taškai žymi transkriptus arba baltymus, kurie reikšmingai skiriasi, kai FDR < 0,05, o tamsesni taškai – transkriptus arba baltymus, kurie reikšmingai skiriasi, kai logaritminis pokytis > 1. Dvipusė statistinė analizė atlikta naudojant DESeq2 Wald testą su Benjamini-Hochbergo koreguotomis p reikšmėmis (transkriptomika) arba Limma linijinio modelio metodą su empirine Bajeso analize, po kurios atlikta Benjamini-Hochbergo korekcija daugybiniams palyginimams (proteomika). C Pasirinktų skirtingai ekspresuotų genų arba baltymų parašo grafikai tarp lėtų ir greitų skaidulų. D Reikšmingai skirtingai ekspresuotų transkriptų ir baltymų praturtinimo analizė. Persidengiančios reikšmės praturtinamos abiejuose duomenų rinkiniuose, transkriptomo reikšmės praturtinamos tik transkriptome, o proteomo reikšmės praturtinamos tik proteome. Statistinė analizė atlikta naudojant „clusterProfiler“ paketą su Benjamini-Hochbergo koreguotomis p reikšmėmis. E. Skaidulų tipui būdingi transkripcijos faktoriai, identifikuoti SCENIC metodu, remiantis SCENIC išvestiniais reguliatorių specifiškumo balais ir skirtinga mRNR raiška tarp skaidulų tipų. F. Pasirinktų transkripcijos faktorių, kurių diferencinė raiška yra lėtose ir greitose skaidulose, profiliavimas.
Tada atlikome skirtingai reprezentuotų genų ir baltymų perteklinio reprezentavimo analizę (4D pav., 13 papildomas duomenų rinkinys). Kelių praturtinimas savybėmis, kurios skyrėsi tarp dviejų duomenų rinkinių, atskleidė laukiamus skirtumus, tokius kaip riebalų rūgščių β oksidacija ir ketonų metabolizmo procesai (lėtosios skaidulos), miofilamentų / raumenų susitraukimas (atitinkamai greitosios ir lėtosios skaidulos) ir angliavandenių kataboliniai procesai (greitosios skaidulos). Serino / treonino baltymų fosfatazės aktyvumas taip pat buvo padidėjęs greitosiose skaidulose, kurį lėmė tokie požymiai kaip reguliaciniai ir kataliziniai fosfatazės subvienetai (PPP3CB, PPP1R3D ir PPP1R3A), kurie, kaip žinoma, reguliuoja glikogeno metabolizmą (47) (papildomi 8D–E paveikslai). Kiti greitosiose skaidulose praturtinti keliai apėmė apdorojimo (P-) kūnelius (YTHDF3, TRIM21, LSM2) proteome (papildomas 8F pav.), kurie gali būti susiję su potranskripciniu reguliavimu (48), ir transkripcijos faktorių aktyvumą (SREBF1, RXRG, RORA) transkriptome (papildomas 8G pav.). Lėtos skaidulos buvo praturtintos oksidoreduktazės aktyvumu (BDH1, DCXR, TXN2) (papildomas 8H pav.), amido surišimu (CPTP, PFDN2, CRYAB) (papildomas 8I pav.), tarpląsteline matrica (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (papildomas 8J pav.) ir receptorių-ligandų aktyvumu (FNDC5, SPX, NENF) (papildomas 8K pav.).
Norėdami geriau suprasti transkripcijos reguliaciją, lemiančią lėtų/greitų raumenų skaidulų tipo charakteristikas, atlikome transkripcijos faktorių praturtinimo analizę naudodami SCENIC49 (papildomas duomenų rinkinys 14). Daugelis transkripcijos faktorių buvo reikšmingai praturtinti tarp greitų ir lėtų raumenų skaidulų (4E pav.). Tai apėmė tokius transkripcijos faktorius kaip MAFA, kuris anksčiau buvo susietas su greitu raumenų skaidulų vystymusi,50 taip pat kelis transkripcijos faktorius, kurie anksčiau nebuvo siejami su raumenų skaidulų tipui būdingomis genų programomis. Iš jų PITX1, EGR1 ir MYF6 buvo labiausiai praturtinti transkripcijos faktoriai greitose raumenų skaidulose (4E pav.). Priešingai, ZSCAN30 ir EPAS1 (taip pat žinomas kaip HIF2A) buvo labiausiai praturtinti transkripcijos faktoriai lėtose raumenų skaidulose (4E pav.). Tai atitinka, kad MAFA buvo ekspresuojamas didesniais lygiais UMAP srityje, atitinkančioje greitas raumenų skaidulas, o EPAS1 turėjo priešingą raiškos modelį (4F pav.).
Be žinomų baltymus koduojančių genų, yra daugybė nekoduojančių RNR biotipų, kurie gali būti susiję su žmogaus vystymosi ir ligų reguliavimu.51, 52 Transkriptomų duomenų rinkiniuose kelios nekoduojančios RNR pasižymi skaidulų tipo specifiškumu (5A pav. ir 15 papildomas duomenų rinkinys), įskaitant LINC01405, kuri yra labai specifiška lėtoms skaiduloms ir, kaip pranešama, jos yra sumažėjusi pacientų, sergančių mitochondrine miopatija, raumenyse.53 Priešingai, RP11-255P5.3, atitinkantis lnc-ERCC5-5 geną (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, pasižymi greitų skaidulų tipo specifiškumu. Tiek LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), tiek RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) pasižymi skeleto raumenų specifiškumu (papildomi 9A–B paveikslai) ir neturi žinomų susitraukimo genų savo 1 Mb genomo aplinkoje, o tai rodo, kad jie atlieka specializuotą vaidmenį reguliuojant skaidulų tipus, o ne reguliuojant gretimus susitraukimo genus. Lėtų/greitų skaidulų tipams būdingi LINC01405 ir RP11-255P5.3 raiškos profiliai buvo patvirtinti naudojant RNAscope (5B–C paveikslai).
A. Nekoduojantys RNR transkriptai yra reikšmingai reguliuojami lėtose ir greitose raumenų skaidulose. B. Tipiniai RNAscope vaizdai, rodantys atitinkamai LINC01405 ir RP11-255P5.3 lėto ir greito susitraukimo skaidulų tipo specifiškumą. Skalės juosta = 50 μm. C. Miofibrilių tipui būdingos nekoduojančios RNR raiškos kiekybinis įvertinimas, nustatytas RNAscope (n = 3 biopsijos iš nepriklausomų asmenų, lyginant greitas ir lėtas raumenų skaidulas kiekviename individui). Statistinė analizė atlikta naudojant dvipusį Student'o t testą. Stačiakampės diagramos rodo medianą ir pirmąjį bei trečiąjį kvartilius, o ūsai rodo minimalias ir maksimalias vertes. D. De novo mikrobinių baltymų identifikavimo darbo eiga (sukurta naudojant BioRender.com). E. Mikrobinis baltymas LINC01405_ORF408:17441:17358 yra specifiškai ekspresuojamas lėtose griaučių raumenų skaidulose (n = 5 biopsijos iš nepriklausomų dalyvių, lyginant greitas ir lėtas raumenų skaidulas kiekviename dalyviu). Statistinė analizė atlikta naudojant Limmo tiesinio modelio metodą kartu su empiriniu Bajeso metodu, o vėliau – Benjamini-Hochbergo metodą daugybiniams palyginimams su p-reikšmės koregavimu. Stačiakampėse diagramose pavaizduota mediana, pirmasis ir trečiasis kvartiliai, o ūsai rodo didžiausias/mažiausias reikšmes.
Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad daugelis tariamų nekoduojančių transkriptų koduoja transkribuotus mikrobinius baltymus, kai kurie iš jų reguliuoja raumenų funkciją.44, 55 Norėdami nustatyti mikrobinius baltymus, turinčius potencialų skaidulų tipo specifiškumą, ieškojome savo 1000 skaidulų proteomo duomenų rinkinyje naudodami pasirinktinį FASTA failą, kuriame yra nekoduojančių transkriptų sekos (n = 305), rastos 1000 skaidulų transkriptomo duomenų rinkinyje (5D pav.). Iš 22 skirtingų transkriptų identifikavome 197 mikrobinius baltymus, iš kurių 71 buvo skirtingai reguliuojamas lėtose ir greitose skeleto raumenų skaidulose (papildomas 9C pav. ir papildomas duomenų rinkinys 16). LINC01405 atveju buvo identifikuoti trys mikrobinių baltymų produktai, iš kurių vienas pasižymėjo panašiu lėtų skaidulų specifiškumu kaip ir jo transkriptas (5E pav. ir papildomas 9D pav.). Taigi, identifikavome LINC01405 kaip geną, koduojantį mikrobinį baltymą, būdingą lėtoms skeleto raumenų skaiduloms.
Sukūrėme išsamią darbo eigą, skirtą didelio masto proteominiam atskirų raumenų skaidulų apibūdinimui, ir nustatėme skaidulų heterogeniškumo reguliatorius sveikose būsenose. Šį darbo eigą pritaikėme, norėdami suprasti, kaip nemalinės miopatijos veikia griaučių raumenų skaidulų heterogeniškumą. Nemalinės miopatijos yra paveldimos raumenų ligos, sukeliančios raumenų silpnumą ir, paveiktiems vaikams, pasireiškiančios įvairiomis komplikacijomis, įskaitant kvėpavimo sutrikimą, skoliozę ir ribotą galūnių judrumą.19,20 Paprastai nemalinių miopatijų atveju patogeniniai genų, tokių kaip aktinas alfa 1 (ACTA1), variantai lemia lėtai susitraukiančių skaidulų miofibrilų sudėties dominavimą, nors šis poveikis yra nevienalytis. Viena pastebima išimtis yra troponino T1 nemalinė miopatija (TNNT1), kurioje vyrauja greitosios skaidulos. Taigi, geresnis heterogeniškumo, slypinčio griaučių raumenų skaidulų disreguliacijos, stebimos nemalinės miopatijos atveju, supratimas gali padėti išsiaiškinti sudėtingą ryšį tarp šių ligų ir miofibrilų tipo.
Palyginti su sveikais kontroliniais asmenimis (n = 3 kiekvienoje grupėje), iš nemalinės miopatijos pacientų, turinčių mutacijas ACTA1 ir TNNT1 genuose, išskirtose miofibrilėse buvo pastebėta ryški miofibrilių atrofija arba distrofija (6A pav., 3 papildoma lentelė). Dėl riboto turimos medžiagos kiekio proteominei analizei tai kėlė didelių techninių iššūkių. Nepaisant to, mums pavyko aptikti 2485 baltymus 272 skeleto miofibrilėse. Išfiltravus bent 1000 kiekybiškai įvertintų baltymų vienoje skaiduloje, 250 skaidulų buvo atlikta tolesnė bioinformatinė analizė. Po filtravimo vidutiniškai buvo kiekybiškai įvertinta 1573 ± 359 baltymų vienoje skaiduloje (papildomas 10A pav., papildomi duomenų rinkiniai 17–18). Pažymėtina, kad nepaisant reikšmingo skaidulų dydžio sumažėjimo, nemalinės miopatijos pacientų mėginių proteomo gylis sumažėjo tik nežymiai. Be to, apdoroję šiuos duomenis naudodami savo FASTA failus (įskaitant nekoduojančius transkriptus), galėjome identifikuoti penkis mikrobinius baltymus nemalino miopatija sergančių pacientų skeleto miofibrilėse (papildomas duomenų rinkinys 19). Proteomo dinaminis diapazonas buvo žymiai platesnis, o bendras baltymų kiekis kontrolinėje grupėje gerai koreliavo su ankstesnės 1000 skaidulų proteomo analizės rezultatais (papildomas 10B–C pav.).
A. Mikroskopiniai vaizdai, rodantys skaidulų atrofiją arba distrofiją ir skirtingų skaidulų tipų dominavimą, remiantis MYH, sergant ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijomis (NM). Mastelio juosta = 100 μm. Siekiant užtikrinti dažymo pakartojamumą ACTA1 ir TNNT1 pacientams, trys pacientų biopsijos buvo dažomos du tris kartus (keturi pjūviai vienam atvejui), prieš pasirenkant reprezentatyvius vaizdus. B. Skaidulų tipų proporcijos dalyviuose, remiantis MYH. C. Skeleto raumenų skaidulų pagrindinių komponenčių analizės (PCA) grafikas pacientams, sergantiems nemalino miopatijomis, ir kontrolinėje grupėje. D. Skeleto raumenų skaidulos iš pacientų, sergančių nemalino miopatijomis, ir kontrolinės grupės, projektuojamos į PCA grafiką, nustatytą iš 1000 skaidulų, analizuotų 2 paveiksle. Pavyzdžiui, ugnikalnio grafikai, kuriuose lyginami skirtumai tarp dalyvių, sergančių ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijomis, ir kontrolinės grupės, bei tarp dalyvių, sergančių ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijomis. Spalvoti apskritimai žymi baltymus, kurie reikšmingai skyrėsi esant π < 0,05, o tamsūs taškai – baltymus, kurie reikšmingai skyrėsi esant FDR < 0,05. Statistinė analizė atlikta naudojant Limma tiesinio modelio metodą ir empirinius Bajeso metodus, o po to p-reikšmės koregavimas daugybiniams palyginimams naudojant Benjamini-Hochbergo metodą. H. Reikšmingai skirtingai ekspresuotų baltymų praturtinimo analizė visame proteome ir 1 bei 2A tipo skaidulose. Statistinė analizė atlikta naudojant „clusterProfiler“ paketą ir Benjamini-Hochbergo koreguotas p-reikšmes. I, J. Pagrindinių komponentų analizės (PCA) grafikai, nuspalvinti tarpląstelinės matricos ir mitochondrijų genų ontologijos (GO) terminais.
Kadangi nemalino miopatijos gali turėti įtakos MYH ekspresuojančių miofibrilių tipų daliai skeleto raumenyse,19,20 pirmiausia ištyrėme MYH ekspresuojančių miofibrilių tipus pacientams, sergantiems nemalino miopatijomis, ir kontrolinėje grupėje. Miofibrilių tipą nustatėme naudodami nešališką metodą, anksčiau aprašytą 1000 miofibrilių tyrimui (papildomi 10D–E pav.), ir vėl nepavyko nustatyti grynų 2X miofibrilių (6B pav.). Stebėjome nevienalytį nemalino miopatijų poveikį miofibrilių tipui, nes dviem pacientams, sergantiems ACTA1 mutacijomis, buvo padidėjusi 1 tipo miofibrilių dalis, o dviem pacientams, sergantiems TNNT1 nemalino miopatija, buvo sumažėjusi 1 tipo miofibrilių dalis (6B pav.). Iš tiesų, MYH2 ir greitųjų troponinų izoformų (TNNC2, TNNI2 ir TNNT3) raiška buvo sumažėjusi sergant ACTA1-nemalino miopatijomis, o MYH7 raiška buvo sumažėjusi sergant TNNT1-nemalino miopatijomis (papildomas 11A pav.). Tai atitinka ankstesnes ataskaitas apie heterogeninį miofibrilų tipo pasikeitimą sergant nemalino miopatijomis.19,20 Šiuos rezultatus patvirtinome imunohistocheminiais tyrimais ir nustatėme, kad pacientams, sergantiems ACTA1-nemalino miopatija, vyravo 1 tipo miofibrilos, o pacientams, sergantiems TNNT1-nemalino miopatija, buvo priešingas modelis (6A pav.).
Vieno skaidulos proteomo lygmenyje ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatija sergančių pacientų skeleto raumenų skaidulos susitelkė su dauguma kontrolinių skaidulų, o TNNT1 nemalino miopatijos skaidulos paprastai buvo labiausiai pažeistos (6C pav.). Tai buvo ypač akivaizdu braižant kiekvieno paciento pseudoišpūstų skaidulų pagrindinių komponenčių analizės (PCA) grafikus, kur TNNT1 nemalino miopatija sergantys pacientai 2 ir 3 atrodė labiausiai nutolę nuo kontrolinių mėginių (papildomas 11B pav., papildomas duomenų rinkinys 20). Siekdami geriau suprasti, kaip miopatija sergančių pacientų skaidulos lyginamos su sveikomis skaidulomis, panaudojome išsamią informaciją, gautą atlikus 1000 sveikų suaugusių dalyvių skaidulų proteominę analizę. Skaidulas iš miopatijos duomenų rinkinio (ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatija sergantys pacientai ir kontrolinė grupė) projektavome į PCA grafiką, gautą atlikus 1000 skaidulų proteominę analizę (6D pav.). MYH skaidulų tipų pasiskirstymas išilgai PC2 kontrolinėse skaidulose buvo panašus į skaidulų pasiskirstymą, gautą atlikus 1000 skaidulų proteominę analizę. Vis dėlto dauguma nemalino miopatija sergančių pacientų skaidulų pasislinko žemyn PC2 kryptimi, sutapdamos su sveikomis greito susitraukimo skaidulomis, nepriklausomai nuo jų natūralaus MYH skaidulų tipo. Taigi, nors pacientams, sergantiems ACTA1 nemalino miopatija, kiekybiškai įvertinus MYH pagrįstus metodus, buvo pastebėtas poslinkis link 1 tipo skaidulų, tiek ACTA1 nemalino miopatija, tiek TNNT1 nemalino miopatija paslinko griaučių raumenų skaidulų proteomą link greito susitraukimo skaidulų.
Tada tiesiogiai palyginome kiekvieną pacientų grupę su sveikų kontrolinių grupių pacientais ir nustatėme atitinkamai 256 ir 552 skirtingai ekspresuojamus baltymus ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijose (6E–G paveikslai ir papildomas 11C paveikslas, papildomas duomenų rinkinys 21). Genų praturtinimo analizė atskleidė koordinuotą mitochondrijų baltymų sumažėjimą (6H–I paveikslai, papildomas duomenų rinkinys 22). Keista, bet nepaisant skirtingo skaidulų tipų dominavimo ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijose, šis sumažėjimas visiškai nepriklausė nuo MYH pagrindu sukurto skaidulų tipo (6H paveikslas ir papildomi 11D–I paveikslai, papildomas duomenų rinkinys 23). Trys mikrobiniai baltymai taip pat buvo reguliuojami ACTA1 arba TNNT1 nemalino miopatijose. Du iš šių mikroproteinų, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (taip pat žinomas kaip LINC00598 arba Lnc-FOXO1) ir ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), pasižymėjo skirtingu gausumu tik 1 tipo miofibrilėse. Anksčiau buvo pranešta, kad ENSG00000215483_TR14_ORF67 atlieka svarbų vaidmenį ląstelių ciklo reguliavime.56 Kita vertus, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (atitinkančio LINC01798) kiekis buvo padidėjęs tiek 1, tiek 2A tipo miofibrilėse sergant ACTA1-nemalino miopatija, palyginti su sveikais kontroliniais asmenimis (papildomas 12A paveikslas, papildomas duomenų rinkinys 24). Priešingai, ribosominiai baltymai nemalino miopatijos beveik nepakito, nors RPS17 buvo sumažintas ACTA1 nemalino miopatijos atveju (6E pav.).
Praturtinimo analizė taip pat atskleidė imuninės sistemos procesų padidėjimą ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijose, o ląstelių adhezija taip pat padidėjo TNNT1 nemalino miopatijos atveju (6H pav.). Šių tarpląstelinių faktorių praturtėjimą atspindėjo tarpląstelinės matricos baltymai, kurie PCA PC1 ir PC2 slanksteliuose paslinko neigiama kryptimi (t. y. link labiausiai pažeistų skaidulų) (6J pav.). Abiejose pacientų grupėse buvo padidėjusi tarpląstelinių baltymų, dalyvaujančių imuniniame atsake ir sarkolemos atstatymo mechanizmuose, tokių kaip aneksinai (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 ir su jais sąveikaujantis baltymas S100A1159 (papildomi 12B–C paveikslai), raiška. Anksčiau buvo pranešta, kad šis procesas sustiprėja raumenų distrofijose60, tačiau, mūsų žiniomis, anksčiau jis nebuvo susijęs su nemalino miopatijomis. Normali šio molekulinio mechanizmo funkcija yra būtina sarkolemos atstatymui po traumos ir naujai susiformavusių miocitų susiliejimui su miofibrilais58,61. Taigi, padidėjęs šio proceso aktyvumas abiejose pacientų grupėse rodo reparacinį atsaką į miofibrilo nestabilumo sukeltą pažeidimą.
Kiekvienos nemalino miopatijos poveikis buvo gerai koreliuojamas (r = 0,736) ir parodė pagrįstą persidengimą (papildomi 11A–B paveikslai), rodantys, kad ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatija turi panašų poveikį proteomai. Tačiau kai kurie baltymai buvo reguliuojami tik ACTA1 arba TNNT1 nemalino miopatijos atveju (papildomi 11A ir C paveikslai). Profibrotinis baltymas MFAP4 buvo vienas iš labiausiai padidintos ekspresijos baltymų TNNT1 nemalino miopatijos atveju, tačiau išliko nepakitęs ACTA1 nemalino miopatijos atveju. SKIC8, PAF1C komplekso komponentas, atsakingas už HOX geno transkripcijos reguliavimą, buvo sumažintas TNNT1 nemalino miopatijos atveju, tačiau nepaveiktas ACTA1 nemalino miopatijos atveju (papildomas 11A paveikslas). Tiesioginis ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijos palyginimas atskleidė didesnį mitochondrijų baltymų sumažėjimą ir imuninės sistemos baltymų padidėjimą sergant TNNT1 nemalino miopatija (6G–H paveikslai ir papildomi 11C ir 11H–I paveikslai). Šie duomenys atitinka didesnę atrofiją/distrofiją, pastebėtą sergant TNNT1 nemalino miopatija, palyginti su TNNT1 nemalino miopatija (6A paveikslas), o tai rodo, kad TNNT1 nemalino miopatija yra sunkesnė ligos forma.
Norėdami įvertinti, ar pastebėtas nemalino miopatijos poveikis išlieka viso raumens lygmenyje, atlikome bendrą tos pačios TNNT1 nemalino miopatijos pacientų kohortos raumenų biopsijų proteominę analizę ir palyginome jas su kontrolinėmis grupėmis (n = 3 kiekvienoje grupėje) (papildomas 13A pav., papildomas duomenų rinkinys 25). Kaip ir tikėtasi, kontrolinės grupės buvo glaudžiai susijusios pagrindinių komponentų analizėje, o TNNT1 nemalino miopatijos pacientai parodė didesnį tarpimtinį kintamumą, panašų į tą, kuris pastebėtas atliekant vieno pluošto analizę (papildomas 13B pav.). Bendra analizė atkūrė skirtingai ekspresuojamus baltymus (papildomas 13C pav., papildomas duomenų rinkinys 26) ir biologinius procesus (papildomas 13D pav., papildomas duomenų rinkinys 27), išryškintus lyginant atskirus pluoštus, tačiau prarado galimybę atskirti skirtingus pluoštų tipus ir neatsižvelgė į nevienalytį ligos poveikį visoms skaiduloms.
Apibendrinus šiuos duomenis, galima teigti, kad vieno miofibrilo proteomika gali išaiškinti klinikinius biologinius požymius, kurių neįmanoma aptikti tiksliniais metodais, tokiais kaip imunoblotavimas. Be to, šie duomenys pabrėžia vien aktino skaidulų tipizavimo (MYH) naudojimo fenotipinei adaptacijai apibūdinti apribojimus. Iš tiesų, nors skaidulų tipo perjungimas skiriasi tarp aktino ir troponino nemalino miopatijų, abi nemalino miopatijos atsieja MYH skaidulų tipizavimą nuo griaučių raumenų skaidulų metabolizmo link greitesnio ir mažiau oksidacinio raumenų proteomo.
Ląstelių heterogeniškumas yra labai svarbus audiniams, kad jie galėtų patenkinti įvairius savo poreikius. Skeleto raumenyse tai dažnai apibūdinama kaip skaidulų tipai, kuriems būdingas skirtingas jėgos gamybos ir nuovargio laipsnis. Tačiau akivaizdu, kad tai paaiškina tik nedidelę skeleto raumenų skaidulų kintamumo dalį, kuri yra daug kintamesnė, sudėtingesnė ir daugialypė, nei manyta anksčiau. Technologinė pažanga dabar nušviečia veiksnius, reguliuojančius skeleto raumenų skaidulas. Iš tiesų, mūsų duomenys rodo, kad 2X tipo skaidulos gali nebūti atskiras skeleto raumenų skaidulų potipis. Be to, mes nustatėme, kad metaboliniai baltymai, ribosominiai baltymai ir su ląstelėmis susiję baltymai yra pagrindiniai skeleto raumenų skaidulų heterogeniškumo veiksniai. Taikydami savo proteomikos darbo eigą pacientų, sergančių nematodų miopatija, mėginiams, mes taip pat parodėme, kad MYH pagrįstas skaidulų tipizavimas ne iki galo atspindi skeleto raumenų heterogeniškumą, ypač kai sistema yra sutrikusi. Iš tiesų, nepriklausomai nuo MYH pagrįsto skaidulų tipo, nematodų miopatija lemia poslinkį link greitesnių ir mažiau oksidacinių skaidulų.
Skeleto raumenų skaidulos klasifikuojamos nuo XIX a. Naujausi omikos tyrimai leido mums pradėti suprasti skirtingų MYH skaidulų tipų raiškos profilius ir jų reakcijas į skirtingus dirgiklius. Kaip aprašyta čia, omikos metodai taip pat turi didesnį jautrumą kiekybiškai įvertinti skaidulų tipo žymenis, palyginti su tradiciniais antikūnais pagrįstais metodais, nes jie nesiremia vieno (ar kelių) žymenų kiekybiniu įvertinimu, kad apibrėžtų skeleto raumenų skaidulų tipą. Mes naudojome papildomus transkriptominius ir proteominius darbo eigą ir integravome rezultatus, kad ištirtume žmogaus skeleto raumenų skaidulų skaidulų heterogeniškumo transkripcijos ir posttranskripcijos reguliaciją. Šis darbo eiga lėmė, kad mūsų kohortos sveikų jaunų vyrų kohortos vastus lateralis raumenyje nepavyko nustatyti grynų 2X tipo skaidulų baltymų lygmenyje. Tai atitinka ankstesnius vieno pluošto tyrimus, kuriuose nustatyta <1 % grynų 2X skaidulų sveikuose vastus lateralis raumenyse, nors tai turėtų būti patvirtinta kituose raumenyse ateityje. Neatitikimas tarp beveik grynų 2X skaidulų aptikimo mRNR lygmenyje ir tik mišrių 2A/2X skaidulų aptikimo baltymų lygmenyje yra gluminantis. MYH izoformos mRNR raiška nėra cirkadinė,67 o tai rodo, kad RNR lygmenyje, regis, grynose 2X skaidulose MYH2 signalo pradžios greičiausiai „nepraleidome“. Vienas galimas paaiškinimas, nors ir grynai hipotetinis, galėtų būti baltymų ir (arba) mRNR stabilumo skirtumai tarp MYH izoformų. Iš tiesų, jokia greita skaidula nėra 100 % gryna jokiai MYH izoformai, ir neaišku, ar MYH1 mRNR raiškos lygis 70–90 % diapazone lemtų vienodą MYH1 ir MYH2 gausą baltymų lygmenyje. Tačiau, vertinant visą transkriptomą arba proteomą, klasterinė analizė gali užtikrintai nustatyti tik du skirtingus klasterius, atstovaujančius lėtoms ir greitoms griaučių raumenų skaiduloms, neatsižvelgiant į tikslią jų MYH sudėtį. Tai atitinka analizę, naudojant vieno branduolio transkriptominius metodus, kurie paprastai identifikuoja tik du skirtingus miobranduolinius klasterius.68, 69, 70 Be to, nors ankstesni proteominiai tyrimai nustatė 2X tipo skaidulas, šios skaidulos nesigrupuoja atskirai nuo likusių greitųjų skaidulų ir rodo tik nedidelį skaičių skirtingai gausių baltymų, palyginti su kitais skaidulų tipais, pagrįstais MYH. 14 Šie rezultatai rodo, kad turėtume grįžti prie XX a. pradžios raumenų skaidulų klasifikavimo požiūrio, kuris žmogaus griaučių raumenų skaidulas skirstė ne į tris atskiras klases pagal MYH, o į dvi grupes pagal jų metabolines ir susitraukimo savybes. 63
Dar svarbiau, kad miofibrilių heterogeniškumą reikėtų vertinti keliais aspektais. Ankstesni „omikos“ tyrimai parodė šią kryptį, teigdami, kad griaučių raumenų skaidulos nesudaro atskirų grupių, o yra išsidėsčiusios išilgai kontinuumo. 11, 13, 14, 64, 71 Čia parodome, kad be griaučių raumenų susitraukimo ir metabolinių savybių skirtumų, miofibrilius galima diferencijuoti pagal požymius, susijusius su ląstelių sąveika ir transliacijos mechanizmais. Iš tiesų, griaučių raumenų skaidulose nustatėme ribosomų heterogeniškumą, kuris prisideda prie heterogeniškumo, nepriklausančio nuo lėtųjų ir greitųjų skaidulų tipų. Pagrindinė šio didelio miofibrilių heterogeniškumo, nepriklausančio nuo lėtųjų ir greitųjų skaidulų tipo, priežastis lieka neaiški, tačiau tai gali rodyti specializuotą erdvinę organizaciją raumenų skaidulose, kurios optimaliai reaguoja į specifines jėgas ir apkrovas, 72 specializuotą ląstelių ar organų specifinę komunikaciją su kitų tipų ląstelėmis raumenų mikroaplinkoje 73, 74, 75 arba ribosomų aktyvumo skirtumus atskirose miofibrilose. Iš tiesų, ribosominė heteroplazma, vykstanti arba per paralogišką RPL3 ir RPL3L pakeitimą, arba rRNR 2′O-metilinimo lygmeniu, yra susijusi su skeleto raumenų hipertrofija . Multiominiai ir erdviniai taikymai kartu su atskirų miofibrilų funkciniu apibūdinimu dar labiau praplės mūsų supratimą apie raumenų biologiją multiominiu lygmeniu .
Analizuodami pacientų, sergančių nemalino miopatijomis, pavienių miofibrilių proteomas, taip pat parodėme pavienių miofibrilių proteomikos naudingumą, efektyvumą ir pritaikomumą griaučių raumenų klinikinei patofiziologijai išsiaiškinti. Be to, palyginę savo darbo eigą su pasauline proteomine analize, galėjome parodyti, kad pavienių miofibrilių proteomika suteikia tokį patį informacijos gylį kaip ir pasaulinė audinių proteomika ir praplečia šį gylį, atsižvelgdami į tarpskaidulinių heterogeniškumą ir miofibrilių tipą. Be laukiamų (nors ir kintamų) skaidulų tipų santykio skirtumų, pastebėtų ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijomis sergančių pacientų, palyginti su sveikais kontroliniais asmenimis,19, taip pat stebėjome oksidacinį ir tarpląstelinį remodeliavimą, nepriklausomą nuo MYH tarpininkaujamo skaidulų tipo perjungimo. Fibrozė anksčiau buvo aprašyta sergant TNNT1 nemalino miopatijomis.19 Tačiau mūsų analizė remiasi šiuo atradimu, taip pat atskleisdama padidėjusį tarpląsteliniu būdu išskiriamų su stresu susijusių baltymų, tokių kaip aneksinai, dalyvaujantys sarkolemos atstatymo mechanizmuose, kiekį pacientų, sergančių ACTA1 ir TNNT1 nemalino miopatijomis, miofibruose.57,58,59 Apibendrinant galima teigti, kad padidėjęs aneksino kiekis pacientų, sergančių nemalino miopatija, miofibruose gali rodyti ląstelių atsaką atkurti labai atrofinius miofibrilus.
Nors šis tyrimas yra didžiausia iki šiol atlikta vieno skaidulos viso raumens omikos analizė su žmonėmis, jis nėra be apribojimų. Skeleto raumenų skaidulas išskyrėme iš santykinai nedidelės ir homogeniškos dalyvių imties bei vieno raumens (šoninio plačiojo šoninio raumens). Todėl neįmanoma atmesti specifinių skaidulų populiacijų egzistavimo skirtinguose raumenų tipuose ir esant kraštutinėms raumenų fiziologijos situacijoms. Pavyzdžiui, negalime atmesti galimybės, kad itin greitų skaidulų pogrupis (pvz., grynos 2X skaidulos) gali atsirasti aukštos kvalifikacijos sprinteriams ir (arba) jėgos atletams79 arba raumenų neaktyvumo laikotarpiais66,80. Be to, ribotas dalyvių imties dydis neleido mums ištirti lyčių skirtumų skaidulų heterogeniškume, nes žinoma, kad skaidulų tipų santykiai tarp vyrų ir moterų skiriasi. Be to, negalėjome atlikti transkriptominės ir proteominės analizių toms pačioms raumenų skaiduloms ar mėginiams iš tų pačių dalyvių. Kadangi mes ir kiti toliau optimizuojame vienaląsčių ir vienaląsčių miofibrų analizę, naudodami omikos analizę, kad pasiektume itin mažą mėginių kiekį (kaip parodyta čia analizuojant pacientų, sergančių mitochondrijų miopatija, skaidulas), tampa akivaizdi galimybė derinti daugiaomikos (ir funkcinius) metodus vienos raumenų skaidulos viduje.
Apskritai mūsų duomenys identifikuoja ir paaiškina transkripcinius ir posttranskripcinius skeleto raumenų heterogeniškumo veiksnius. Konkrečiai, pateikiame duomenis, kurie meta iššūkį ilgalaikei skeleto raumenų fiziologijos dogmai, susijusiai su klasikiniu MYH pagrindu sudarytu skaidulų tipų apibrėžimu. Tikimės atnaujinti diskusijas ir galiausiai permąstyti mūsų supratimą apie skeleto raumenų skaidulų klasifikaciją ir heterogeniškumą.
Keturiolika baltaodžių dalyvių (12 vyrų ir 2 moterys) savanoriškai sutiko dalyvauti šiame tyrime. Tyrimą patvirtino Gento universitetinės ligoninės etikos komitetas (BC-10237), jis atitiko 2013 m. Helsinkio deklaraciją ir buvo užregistruotas svetainėje ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Bendros dalyvių charakteristikos pateiktos 1 papildomoje lentelėje. Gavus žodinį ir rašytinį informuotą sutikimą, dalyviai prieš galutinį įtraukimą į tyrimą buvo patikrinti sveikatos. Dalyviai buvo jauni (22–42 metų), sveiki (neturėjo sveikatos sutrikimų, nerūkė) ir vidutiniškai fiziškai aktyvūs. Maksimalus deguonies suvartojimas buvo nustatytas naudojant laiptelio ergometrą fiziniam pasirengimui įvertinti, kaip aprašyta anksčiau.81
Raumenų biopsijos mėginiai buvo renkami ramybės būsenoje ir nevalgius tris kartus, kas 14 dienų. Kadangi šie mėginiai buvo renkami kaip didesnio tyrimo dalis, dalyviai 40 minučių prieš biopsiją vartojo placebą (laktozę), H1 receptorių antagonistą (540 mg feksofenadino) arba H2 receptorių antagonistą (40 mg famotidino). Anksčiau įrodėme, kad šie histamino receptorių antagonistai neturi įtakos skeleto raumenų ramybės būsenos būklei81, ir mūsų kokybės kontrolės diagramose (papildomi 3 ir 6 paveikslai) nebuvo pastebėta jokių su raumenų būkle susijusių klasterizacijų. 48 valandas prieš kiekvieną eksperimentinę dieną buvo laikomasi standartizuotos dietos (41,4 kcal/kg kūno svorio, 5,1 g/kg kūno svorio angliavandenių, 1,4 g/kg kūno svorio baltymų ir 1,6 g/kg kūno svorio riebalų), o eksperimentinės dienos rytą buvo valgomi standartizuoti pusryčiai (1,5 g/kg kūno svorio angliavandenių). Taikant vietinę nejautrą (0,5 ml 1 % lidokaino be epinefrino), iš šoninio raumens (vastus lateralis) buvo paimtos raumenų biopsijos, naudojant perkutaninę Bergströmo aspiraciją.82 Raumenų mėginiai buvo nedelsiant įterpti į „RNAlater“ ir laikomi 4 °C temperatūroje iki rankinio skaidulų preparavimo (iki 3 dienų).
Šviežiai izoliuoti miofibrilų pluoštai buvo perkelti į šviežią RNAlater terpę kultūros lėkštelėje. Atskiri miofibrilai buvo rankiniu būdu išpreparuoti naudojant stereomikroskopą ir plonus pincetus. Iš kiekvienos biopsijos buvo išpreparuoti dvidešimt penki pluoštai, ypatingą dėmesį skiriant pluoštų parinkimui iš skirtingų biopsijos sričių. Po preparavimo kiekvienas pluoštas buvo švelniai panardintas į 3 μl lizės buferio („SingleShot Cell Lysis Kit“, „Bio-Rad“), kuriame yra proteinazės K ir DNazės fermentų, siekiant pašalinti nepageidaujamus baltymus ir DNR. Ląstelių lizė ir baltymų/DNR pašalinimas buvo inicijuoti trumpai sumaišant, sukant skystį mikrocentrifugoje ir inkubuojant kambario temperatūroje (10 min.). Tada lizatas buvo inkubuojamas terminio ciklo įrenginyje (T100, „Bio-Rad“) 37 °C temperatūroje 5 min., 75 °C temperatūroje 5 min., o po to nedelsiant laikomas -80 °C temperatūroje iki tolesnio apdorojimo.
Iš 2 µl miofibrilų lizato, naudojant „QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit“ (Lexogen), buvo paruoštos su Illumina suderinamos poliadenilintos RNR bibliotekos. Išsamius metodus galite rasti gamintojo vadove. Procesas prasideda nuo pirmos grandinės kDNR sintezės atvirkštinės transkripcijos būdu, kurios metu įvedami unikalūs molekuliniai identifikatoriai (UMI) ir mėginiui būdingi i1 brūkšniniai kodai, siekiant užtikrinti mėginių sujungimą ir sumažinti techninį kintamumą tolesnio apdorojimo metu. Tada 96 miofibrilų kDNR sujungiama ir išgryninama magnetinėmis granulėmis, po to pašalinama RNR ir atliekama antros grandinės sintezė naudojant atsitiktinius pradmenis. Biblioteka išgryninama magnetinėmis granulėmis, pridedamos telkiniui būdingos i5/i7 žymės ir amplifikuojama PGR. Paskutinio gryninimo etapo metu gaunamos su Illumina suderinamos bibliotekos. Kiekvieno bibliotekos telkinio kokybė buvo įvertinta naudojant didelio jautrumo mažų fragmentų DNR analizės rinkinį („Agilent Technologies“, DNF-477-0500).
Remiantis Qubit kiekybiniu įvertinimu, telkiniai buvo toliau kaupiami ekvimolinėmis koncentracijomis (2 nM). Gautas telkinys buvo sekvenuotas „NovaSeq 6000“ prietaisu standartiniu režimu, naudojant „NovaSeq S2“ reagentų rinkinį (1 × 100 nukleotidų) su 2 nM įkrova (4 % PhiX).
Mūsų duomenų srautas pagrįstas „Lexogen“ „QuantSeq Pool“ duomenų analizės srautu (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Pirmiausia duomenys buvo demultipleksuoti naudojant „bcl2fastq2“ (v2.20.0), remiantis i7/i5 indeksu. 2-asis nuskaitymas buvo demultipleksuotas naudojant „idemux“ (v0.1.6), remiantis i1 mėginio brūkšniniu kodu, o UMI sekos buvo išskirtos naudojant „umi_tools“ (v1.0.1). Nuskaitymai buvo keliais etapais apkarpyti naudojant „cutadapt“ (v3.4), kad būtų pašalinti trumpi nuskaitymai (<20 ilgio) arba nuskaitymai, sudaryti tik iš adapterio sekų. Nuskaitymai buvo sulygiuoti su žmogaus genomu naudojant STAR (v2.6.0c), o BAM failai buvo indeksuoti naudojant SAMtools (v1.11). Pasikartojantys nuskaitymai buvo pašalinti naudojant „umi_tools“ (v1.0.1). Galiausiai, lygiavimo skaičiavimas buvo atliktas naudojant „featureCounts“ programoje „Subread“ (v2.0.3). Kokybės kontrolė buvo atlikta naudojant „FastQC“ (v0.11.9) keliuose tarpiniuose vamzdyno etapuose.
Visas tolesnis bioinformatikos apdorojimas ir vizualizavimas buvo atlikti R (v4.2.3) programoje, daugiausia naudojant „Seurat“ (v4.4.0) darbo eigą.83 Todėl individualios UMI reikšmės ir metaduomenų matricos buvo transformuotos į „Seurat“ objektus. Genai, išreikšti mažiau nei 30 % visų skaidulų, buvo pašalinti. Žemos kokybės mėginiai buvo pašalinti remiantis minimaliu 1000 UMI reikšmių ir 1000 aptiktų genų slenksčiu. Galiausiai 925 skaidulos praėjo visus kokybės kontrolės filtravimo etapus. UMI reikšmės buvo normalizuotos naudojant „Seurat SCTransform v2“ metodą,84 įskaitant visus 7418 aptiktus požymius, o skirtumai tarp dalyvių buvo regresiškai pašalinti. Visus svarbius metaduomenis galite rasti 28 papildomame duomenų rinkinyje.